Name: a method for production of recombinant mcd1d protein in insect cells.
Uploaded: 2007-12-10T22:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells. at JoVE.com

<p class="jove_step"> I. auftauen Cells </p><p class="jove_content"> Nehmen Sie das Gefriergut Fläschchen TN5-Zellen und Auftauen in einem 37 ° C Wasserbad. Fügen Sie 5ml von Insekten Express-Medium (Invitrogen, Katalog-Nummer-10486) in 25cm <sup>2</sup> TC Kolben. Beachten Sie, dass Express fünf, ohne Glutamin kommt; müssen 10ml 100X Glutamin Stift Strep oder Glutamin allein zu 1 lt Medien hinzufügen. Add TN5 Zellen hinein und inkubieren für 30 Minuten in ein 27 ° C Inkubator. Dann saugen das Medium mit DMSO vorsichtig, ohne die Zellen...

<ol>
	<li>Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+identification+of+glycolipipd+antigen-specific+T+cells+using+fluorecent+CD1d+tetramers.">In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers.</a> <em style='font-style: italic'>J. Exp. Med</em>. <b>191</b>, 1895-1903 (2000).</li><li>Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+bacterial+glycosphingolipids+by+natural+killer+T+cells.">Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells.</a> <em style='font-style: italic'>Nature</em>. <b>434</b>, 520-525 (2005).</li><li>Naidenko, O. V., Maher, J. K., Ernst, W. A., Sakai, T., Modlin, R. L., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+and+antigen+presentation+of+ceramide-containing+glycolipids+by+soluble+mouse+and+human+CD1d+molecules.">Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules.</a> <em style='font-style: italic'>J. Exp. Med</em>. <b>190</b>, 1069-1080 (1999).</li><li>Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD1+family:+A+third+lineage+of+antigen-+presenting+molecules.">The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules.</a> <em style='font-style: italic'>Adv. Immunol</em>. <b>59</b>, 1-98 (1995).</li><li>Sidobre, S., Kronemberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1+tetramers:+A+powerful+tool+for+the+analysis+of+glycolipid-reactive+T+cells.">CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells.</a> <em style='font-style: italic'>J. Immunol</em>. <b>169</b>, 1340-1348 (2002).</li></ol>

<p> In diesem Verfahren wird gezeigt, wie zu initiieren, zu wachsen, zu infizieren Insektenzellen und wie die Baculovirus Verwendung dieser Zellen Titer. Die wichtigsten Aspekte dieses Verfahrens sind Wartung von Zellen und die genaue Titer von Baculovirus wissen. Sobald Sie CD1 Tetramere erzeugt wird, kann sie als ein mächtiges Werkzeug zur Analyse von Glycolipid reaktiven T-Zellen verwendet werden. Baculovirus-Systeme sind ebenfalls weit verbreitet, rekombinante Proteine, darunter MHC-Klasse-II-Tetramere so dieses Verfahren hat eine viel bre...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Express Five SFM</td>
<td> Serum Free Medium</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10486025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High Five TM</td>
<td> Insect Cells</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>B855-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutamine Pen strep</td>
<td>Antibiotics</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10378-016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25cm2 TC Flask</td>
<td> Plastic</td>
<td>Fisher</td>
<td>10-126-28</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>175 cm2 TC Flask</td>
<td> Plug seal flask</td>
<td>Fisher</td>
<td>10-126-8</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Erlenmeyer Flask</td>
<td>   Cell Culture Flask</td>
<td>Fisher</td>
<td>07 200 672</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>YM 30 Concenterator</td>
<td>30,000 MWCO</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC 903096</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FPLC equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BrA Enzyme and Buffer</td>
<td> Biotinylation Kit</td>
<td>Avidity</td>
<td>BIRA500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ni-NTA Agarose Column</td>
<td>His Tag Protein Purification Column</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Desalting column</td>
<td> To get Rod of Salt from Protein</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MonoQ  Column</td>
<td>Anion Exchange Chromatgraphy</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>S200 Column</td>
<td> Size Exclusion Chromatography</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>alpha-Galcer</td>
<td> Glycolipid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PE- Streptavidin</td>
<td>  For conjugating Protein</td>
<td>Molecular Probe</td>
<td> S-866</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

a method for production of recombinant mcd1d protein in insect cells.

<p class="jove_content"> CD1-Proteine ​​bilden eine dritte Klasse von Antigen-präsentierenden Molekülen. Sie sind Zelloberfläche Glykoproteine, wie etwa 50-kDa glykosylierten schweren Ketten, die kovalent mit beta2-Mikroglobulin assoziiert sind Ausdruck. Sie binden Lipide als Peptide. Obwohl die Struktur bestätigt die Ähnlichkeit der CD1-Proteine ​​auf MHC Klasse I und Klasse II Antigen-präsentierenden Molekülen ist die mCD1d Nut relativ schmal, tief und stark hydrophob und hat zwei Bindungstaschen statt der mehrere flache Taschen für die klassische beschriebenen MHC- kodierte Antigen-präsentierenden Molekülen. Basierend auf ihren Aminosäuresequenzen, bietet eine solche hydrobphobic Nut ein ideales Umfeld für die Bindung von Lipid-Antigene. </p><p class="jove_content"> Die Natural Killer T (NKT-Zellen) nutzen ihre TCR an Glykolipide gebunden oder presented by CD1d erkennen. Reaktive T-Zellen, Lipide zu CD1 präsentiert haben in den Schutz gegen Autoimmun-und Infektionskrankheiten sowie in Tumorabstoßung beteiligt. So ist die Fähigkeit zu erkennen, zu reinigen, und verfolgen Sie die Reaktion der CD1-reaktiven NKT Zellen von großer Bedeutung. Die Erzeugung von Tetrameren von alpha Galactosylceramid (a-GalCer) mit CD1d hat einen tiefen Einblick in die Biologie von NKT-Zellen. Tetramere aus anderen CD1-Moleküle konstruiert wurden ebenfalls erzeugt und diese neue Reagenzien haben stark das Wissen um die Funktionen von Lipid-reaktiven T-Zellen erweitert, mit potenziellen Einsatz bei der Überwachung der Reaktion auf Lipid-basierte Impfstoffe und in der Diagnostik von Autoimmunerkrankungen und andere Behandlungen. </p>

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A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

<p class="jove_content">Eine Methode, um Insektenzellen vorzubereiten und infizieren sie mit Baculovirus für die Zwecke der Produktion von rekombinanten mCD1d proteinand Erzeugung mCD1d Tetramere.</p>

Ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Protein in mCD1d Insektenzellen.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Research

JoVE Journal

Biology

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing: Eine einfache Methode für genaue Genotypisierung

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Forschung

Biologie

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Ein Protokoll für die Phagen-Display-und Affinity Auswahl mit rekombinantem Protein-Köder

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Optimization and Utilization of <em>Agrobacterium</em>-mediated Transient Protein Production in <em>Nicotiana</em>

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimierung und Nutzung von<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Transient-vermittelte Proteinproduktion in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Effizienten Herstellung und Reinigung von rekombinantem murinem Kindlin-3 von Insektenzellen für biophysikalische Studien

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen Mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

Expression rekombinanter Proteine ​​für Strukturbiologie in HEK 293F Suspensionszellen: eine neue und Barriere Ansatz

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in <em>Escherichia coli</em>

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Eine vergleichende Analyse der Expression rekombinanter Proteine ​​in verschiedenen Biofabrik: Bakterien, Insektenzellen und Pflanzensysteme

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...