Name: a method for production of recombinant mcd1d protein in insect cells.
Uploaded: 2007-12-10T22:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells. at JoVE.com

<p class="jove_step"> I. Scongelare le cellule </p><p class="jove_content"> Prendere il flacone ghiacciato di TN5 cellule, e scongelare in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. Aggiungere 5 ml di media insetti Express (Invitrogen, numero di catalogo-10486) a 25 centimetri <sup>2</sup> fiasco TC. Si noti che cinque viene espresso senza Glutammina; bisogno di aggiungere 10 ml di streptococco penna 100X glutammina o glutammina da sola a 1 lt dei media. Aggiungi TN5 cellule in esso e incubare per 30 minuti in un incubatore 27 ° C. Poi, aspirare il terre...

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	<li>Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+identification+of+glycolipipd+antigen-specific+T+cells+using+fluorecent+CD1d+tetramers.">In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers.</a> <em style='font-style: italic'>J. Exp. Med</em>. <b>191</b>, 1895-1903 (2000).</li><li>Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+bacterial+glycosphingolipids+by+natural+killer+T+cells.">Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells.</a> <em style='font-style: italic'>Nature</em>. <b>434</b>, 520-525 (2005).</li><li>Naidenko, O. V., Maher, J. K., Ernst, W. A., Sakai, T., Modlin, R. L., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+and+antigen+presentation+of+ceramide-containing+glycolipids+by+soluble+mouse+and+human+CD1d+molecules.">Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules.</a> <em style='font-style: italic'>J. Exp. Med</em>. <b>190</b>, 1069-1080 (1999).</li><li>Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD1+family:+A+third+lineage+of+antigen-+presenting+molecules.">The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules.</a> <em style='font-style: italic'>Adv. Immunol</em>. <b>59</b>, 1-98 (1995).</li><li>Sidobre, S., Kronemberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1+tetramers:+A+powerful+tool+for+the+analysis+of+glycolipid-reactive+T+cells.">CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells.</a> <em style='font-style: italic'>J. Immunol</em>. <b>169</b>, 1340-1348 (2002).</li></ol>

<p> In questa procedura, viene mostrato come iniziare, crescere, infettare cellule di insetto e come titolo il baculovirus utilizzando queste cellule. Gli aspetti più importanti di questa procedura sono la manutenzione delle celle e di conoscerne il titolo esatto del baculovirus. Una volta che avete generato CD1 tetrameri, possono essere utilizzati come un potente strumento per l&#39;analisi dei glicolipidi cellule T reattive. Baculovirus sistemi sono ampiamente utilizzati anche per la produzione di proteine ​​ricombinanti, compresa tetram...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Express Five SFM</td>
<td> Serum Free Medium</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10486025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High Five TM</td>
<td> Insect Cells</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>B855-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutamine Pen strep</td>
<td>Antibiotics</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10378-016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25cm2 TC Flask</td>
<td> Plastic</td>
<td>Fisher</td>
<td>10-126-28</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>175 cm2 TC Flask</td>
<td> Plug seal flask</td>
<td>Fisher</td>
<td>10-126-8</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Erlenmeyer Flask</td>
<td>   Cell Culture Flask</td>
<td>Fisher</td>
<td>07 200 672</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>YM 30 Concenterator</td>
<td>30,000 MWCO</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC 903096</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FPLC equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BrA Enzyme and Buffer</td>
<td> Biotinylation Kit</td>
<td>Avidity</td>
<td>BIRA500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ni-NTA Agarose Column</td>
<td>His Tag Protein Purification Column</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Desalting column</td>
<td> To get Rod of Salt from Protein</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MonoQ  Column</td>
<td>Anion Exchange Chromatgraphy</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>S200 Column</td>
<td> Size Exclusion Chromatography</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>alpha-Galcer</td>
<td> Glycolipid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PE- Streptavidin</td>
<td>  For conjugating Protein</td>
<td>Molecular Probe</td>
<td> S-866</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

a method for production of recombinant mcd1d protein in insect cells.

<p class="jove_content"> CD1 proteine ​​costituiscono una terza classe di molecole presentanti l&#39;antigene. Si tratta di glicoproteine ​​della superficie cellulare, espresso in circa 50-kDa glicosilata catene pesanti che sono associati con noncovalently beta2-microglobulina. Si legano i lipidi piuttosto che peptidi. Anche se la loro struttura conferma la somiglianza dei CD1 proteine ​​MHC di classe I e molecole di classe II che presentano l&#39;antigene, il groove mCD1d è relativamente stretta, profonda e altamente idrofoba e ha due tasche vincolanti anziché le tasche diverse superficiale descritto per la classica MHC- codificati che presentano l&#39;antigene molecole. In base al loro sequenze di aminoacidi, come un solco hydrobphobic fornisce un ambiente ideale per il legame di antigeni lipidici. </p><p class="jove_content"> Il Natural Killer T (NKT) le cellule utilizzano per riconoscere il loro TCR glicolipidi legato o presentato da CD1d. Cellule T reattive di lipidi presentati da CD1 sono stati coinvolti nella protezione contro le malattie autoimmuni e infettive e nel rifiuto del tumore. Così, la capacità di identificare, purificare e tenere traccia la risposta del CD1-reattiva delle cellule NKT è di grande importanza. La generazione di tetrameri di alfa galattosiltransferasi ceramide (a-Galcer) con CD1d ha una visione significativa sulla biologia delle cellule NKT. Tetrameri costruite da altre molecole CD1 sono stati generati e questi nuovi reagenti hanno notevolmente ampliato la conoscenza delle funzioni di lipidi cellule T reattive, con un potenziale utilizzo nel monitoraggio della risposta ai vaccini a base di lipidi e nella diagnosi delle malattie autoimmuni e di altre trattamenti. </p>

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A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

<p class="jove_content">Un metodo per preparare le cellule degli insetti e infettare con baculovirus per la produzione di ricombinante proteinand mCD1d generare tetrameri mCD1d.</p>

Un metodo per la produzione di proteine ​​ricombinanti mCD1d in cellule di insetto.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

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