Name: analysis of retinoic acid-induced neural differentiation of mouse embryonic stem cells in two and three-dimensional embryoid bodies
Uploaded: 2017-04-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies at JoVE.com

Cette étude a été soutenue par subvention du NIH R01 HL119984 AH

1. La culture de fibroblastes embryonnaires de souris (FAE) <ol><li> Préparer le milieu MEF, le milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM, à haute glucose), supplémenté avec 15% de sérum de fœtus bovin (FBS). </li><li> Manteau de 100 mm des boîtes de culture cellulaire avec une solution de gélatine à 0,5% pendant 30 min à température ambiante (RT). </li><li> Count en utilisant un cytomètre FAE. Retirer la solution de gélatine et verser immédiatement milieu MEF pré-chauffé à 37 ° C. Décongeler rapi...

<ol>
	<li>Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiating+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies.">Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies.</a> Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).</li><li>Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+compromising+the+three+embryonic+germ+layers.">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers.</a> Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).</li><li>Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+embryoid+body+formation+and+hematopoietic+development+from+embryonic+stem+cells+in+different+culture+systems.">Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems.</a> Biotechnol Bioeng. 78 (4), 442-453 (2002).</li><li>Johansson, S., Svineng, G., Wennerberg, K., Armulik, A., Lohikangas, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-integrin+interactions.">Fibronectin-integrin interactions.</a> Front Biosci. 2, d126-d146 (1997).</li><li>Blumberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+retinoid+signaling+in+anteroposterior+neural+specification+and+neuronal+differentiation.">An essential role for retinoid signaling in anteroposterior neural specification and neuronal differentiation.</a> Semin Cell Dev Biol. 8 (4), 417-428 (1997).</li><li>Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoids+in+embryonal+development.">Retinoids in embryonal development.</a> Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).</li><li>Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+promotes+neural+and+represses+mesodermal+gene+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells+in+culture.">Retinoic acid promotes neural and represses mesodermal gene expression in mouse embryonic stem cells in culture.</a> Biochem Biophys Res Commun. 223 (3), 691-694 (1996).</li><li>Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic-acid-concentration-dependent+acquisition+of+neural+cell+identity+during+in+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Dev Biol. 275 (1), 124-142 (2004).</li><li>Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+synthesis+and+signaling+during+early+organogenesis.">Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis.</a> Cell. 134 (6), 921-931 (2008).</li><li>Niederreither, K., Dolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+in+development:+towards+an+integrated+view.">Retinoic acid in development: towards an integrated view.</a> Nat Rev Genet. 9 (7), 541-553 (2008).</li><li>Maden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+in+the+development,+regeneration+and+maintenance+of+the+nervous+system.">Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system.</a> Nat Rev Neurosci. 8 (10), 755-765 (2007).</li><li>Sheng, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+regulates+bone+morphogenic+protein+signal+duration+by+promoting+the+degradation+of+phosphorylated+Smad1.">Retinoic acid regulates bone morphogenic protein signal duration by promoting the degradation of phosphorylated Smad1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18886-18891 (2010).</li><li>Gajovic, S., St-Onge, L., Yokota, Y., Gruss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+mediates+Pax6+expression+during+in+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">Retinoic acid mediates Pax6 expression during in vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Differentiation. 62 (4), 187-192 (1997).</li><li>Dong, D., Ruuska, S. E., Levinthal, D. J., Noy, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+cellular+retinoic+acid-binding+proteins+I+and+II+in+regulating+signaling+by+retinoic+acid.">Distinct roles for cellular retinoic acid-binding proteins I and II in regulating signaling by retinoic acid.</a> J Biol Chem. 274 (34), 23695-23698 (1999).</li><li>Sessler, R. J., Noy, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ligand-activated+nuclear+localization+signal+in+cellular+retinoic+acid+binding+protein-II.">A ligand-activated nuclear localization signal in cellular retinoic acid binding protein-II.</a> Mol Cell. 18 (3), 343-353 (2005).</li><li>Tang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIRT1-Mediated+Deacetylation+of+CRABPII+Regulates+Cellular+Retinoic+Acid+Signaling+and+Modulates+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation.">SIRT1-Mediated Deacetylation of CRABPII Regulates Cellular Retinoic Acid Signaling and Modulates Embryonic Stem Cell Differentiation.</a> Mol Cell. 55 (6), 843-855 (2014).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+inhibits+neural+differentiation+in+murine+stem+cells+through+multiple+mechanisms.">RhoA inhibits neural differentiation in murine stem cells through multiple mechanisms.</a> Sci Signal. 9 (438), ra76 (2016).</li><li>Garnaas, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syx,+a+RhoA+guanine+exchange+factor,+is+essential+for+angiogenesis+in+Vivo.">Syx, a RhoA guanine exchange factor, is essential for angiogenesis in Vivo.</a> Circ Res. 103 (7), 710-716 (2008).</li><li>Chou, Y. H., Khuon, S., Herrmann, H., Goldman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin+promotes+the+phosphorylation-dependent+disassembly+of+vimentin+intermediate+filaments+during+mitosis.">Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis.</a> Mol Biol Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).</li><li>Arai, T., Matsumoto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+functionally+differentiated+microtubules+in+squid+neurons:+regional+distribution+of+microtubule-associated+proteins+and+beta-tubulin+isotypes.">Subcellular localization of functionally differentiated microtubules in squid neurons: regional distribution of microtubule-associated proteins and beta-tubulin isotypes.</a> J Neurochem. 51 (6), 1825-1838 (1988).</li><li>Arnhold, S., Klein, H., Semkova, I., Addicks, K., Schraermeyer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurally+selected+embryonic+stem+cells+induce+tumor+formation+after+long-term+survival+following+engraftment+into+the+subretinal+space.">Neurally selected embryonic stem cells induce tumor formation after long-term survival following engraftment into the subretinal space.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (12), 4251-4255 (2004).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+receptor+beta+mediates+the+growth-inhibitory+effect+of+retinoic+acid+by+promoting+apoptosis+in+human+breast+cancer+cells.">Retinoic acid receptor beta mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in human breast cancer cells.</a> Mol Cell Biol. 16 (3), 1138-1149 (1996).</li><li>Altucci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-induced+apoptosis+in+leukemia+cells+is+mediated+by+paracrine+action+of+tumor-selective+death+ligand+TRAIL.">Retinoic acid-induced apoptosis in leukemia cells is mediated by paracrine action of tumor-selective death ligand TRAIL.</a> Nat Med. 7 (6), 680-686 (2001).</li><li>Pettersson, F., Dalgleish, A. G., Bissonnette, R. P., Colston, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoids+cause+apoptosis+in+pancreatic+cancer+cells+via+activation+of+RAR-gamma+and+altered+expression+of+Bcl-2/Bax.">Retinoids cause apoptosis in pancreatic cancer cells via activation of RAR-gamma and altered expression of Bcl-2/Bax.</a> Br J Cancer. 87 (5), 555-561 (2002).</li><li>Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+matrix+microenvironment+for+targeted+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+neural+and+glial+lineages.">3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages.</a> Biomaterials. 34 (25), 5995-6007 (2013).</li><li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+and+TGF-beta+pathway+mediators+are+critical+upstream+regulators+of+Wnt+signaling+during+midbrain+dopamine+differentiation+in+human+pluripotent+stem+cells.">BMP and TGF-beta pathway mediators are critical upstream regulators of Wnt signaling during midbrain dopamine differentiation in human pluripotent stem cells.</a> Dev Biol. 376 (1), 62-73 (2013).</li></ol>

Dans ce protocole, nous présentons une méthode relativement simple et accessible pour étudier la différenciation neuronale des souris CES. Dans les protocoles précédents, RA a été ajouté au milieu au jour 2 ou 4 jours de la tenture-drop EB 8 ou par culture en suspension 7, respectivement, ou immédiatement après l&#39;agrégation goutte suspendue EB 21. Dans le protocole que nous avons conçu, RA a été ajouté plus tôt. En dépit de la ...

Proviennent de la CES masse cellulaire interne blastocyste. Ces cellules sont pluripotentes, à savoir qu&#39;ils ont la capacité de se différencier en n&#39;importe quel type de cellule de l&#39;organisme d&#39;origine. ESC différenciation in vitro est d&#39; un grand intérêt en tant que système expérimental pour étudier les voies de développement et les mécanismes. Il offre un système de modèle puissant et flexible pour tester de nouvelles approches thérapeutiques pour la correction du dysfonctionnement des cellules et des tissus. Récapitulent de nombreux aspects EBs de la différenciation cellulaire au cours de l&#39;embryogenèse précoce. En particulier EbS peuvent être utilisés lorsque l&#39; embryon rend la létalité difficile de déterminer la base cellulaire des défauts embryonnaires 1, 2. EB peuvent être formés soit par des techniques de suspension goutte suspendue ou liquides 3. L&#39;avantage de la première est la capacité de générer des EBs de taille uniforme et de densité, facilitant ainsi la reproductibilité expérimentale. <p class = « jove_content »&gt; L&#39;interaction avec les protéines d&#39;adhésion matrice extracellulaire (ECM) peut affecter la motilité et la survie des cellules adhérentes. Dans le système de culture 2D, la fibronectine est souvent appliquée pour augmenter l&#39;adhérence des cellules au substrat. La fibronectine est un composant de membrane basale reconnu par 10 types de surface cellulaire hétérodimères d&#39; intégrines 4. RA est un petit métabolite lipophile de la vitamine A qui induit la différenciation des neurones 5, 6. De fortes concentrations de RA favorisent l&#39; expression du gène de neurones et réprime l&#39; expression du gène mésodermique pendant la formation EB 7, 8. RA est produite par oxydation de la vitamine A rétinaldéhyde soit par l&#39;alcool déshydrogénase ou rétinol, suivie d&#39; une oxydation de rétinaldéhyde pour le produit final par le rétinaldéhyde déshydrogénase 9. différenciation neurale nécessite le transport de la PR du cytoplasme<html> au noyau par la protéine de liaison cellulaire RA-2 (CRABP2). Dans le noyau, RA se lie à son récepteur apparenté complexe consistant en un hétérodimère RAR-RXR 10. Cela se traduit par le recrutement de co-activateurs de transcription et l&#39;initiation de la transcription 9, 11. En outre, RA favorise la dégradation de phosphorylé (active) SMAD1, ainsi antagoniser la signalisation BMP et SMAD 12. En plus de ces activités, RA augmente l&#39; expression de Pax6, un facteur de transcription qui favorise la différenciation des neurones 13. La signalisation de la PR est modulée par sirtuines-1 (Sirt1), une nicotinamide adénine dinucléotide nucléaire (NAD +) - enzyme dépendante qui désacétyle CRABP2, en interférant avec sa translocation vers le noyau, et donc avec RA liaison à l&#39;hétérodimère RAR-RXR 14, 15, 16. e_content &quot;&gt; Notre objectif dans la conception du protocole EB-traité RA décrit ici est d&#39;optimiser la différenciation neuronale afin de faciliter l&#39; analyse in vitro des voies de signalisation qui régulent la différenciation ESC dans les cellules précurseurs neuronaux. L&#39; un des avantages de ce protocole est la facilitation de l&#39;analyse de la fonction des cellules par immunofluorescence. 3D EB ne sont pas bien pénétré par les anticorps et sont difficiles à image. dissociation EB dans une monocouche 2D à des moments spécifiques au cours de la différenciation neuronale facilite l&#39;immunomarquage et l&#39;imagerie des cellules par microscopie confocale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEFs</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PMEF-CF</td>
			<td>ESC feeder layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESC</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CMTI-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (60 mm)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30701119</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (100 mm)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td>Hanging drops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td>2D EBs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30720113</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark 1.5 ml centrifuge tube</td>
			<td>Celltreat Scientific Products</td>
			<td>229437</td>
			<td>RA stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover-glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td>Circular, 12 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost-plus microscope slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D collagen culture kit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ECM675</td>
			<td>3D culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Effectene Transfection Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>301427</td>
			<td>Stem cell transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcon&#160;Centrifugal Filters (10 kDa)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>MRCPRT010</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-709F</td>
			<td>MEFs culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440-046</td>
			<td>ESCs culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ES-009-B</td>
			<td>ESCs culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2625</td>
			<td>Dish coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>8878-LF-025</td>
			<td>To maintain ESC pluripotency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solutions</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750060</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoZap Plus-PR</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VZA-2022</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans-retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td>Induction of neural differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030-50G</td>
			<td>Blocking and antibody dilution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td>Cell membrane permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI</td>
			<td>Life Tech.</td>
			<td>P36931</td>
			<td>Mounting reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1030-FN</td>
			<td>Dish coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Worthington Biochem. Corp</td>
			<td>LS004196</td>
			<td>EB dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Primary Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin (Rat-401)</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-33677</td>
			<td>Detection of neural differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct4</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-5279</td>
			<td>Detection of neural differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanog</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-398A</td>
			<td>Detection of neural differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3579</td>
			<td>Detection of neural differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin b3 (AA10)</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-80016</td>
			<td>Detection of neural differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Secondary Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse-Alexa555</td>
			<td>Life Tech.</td>
			<td>A31570</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse-Alexa488&#160;</td>
			<td>Life Tech.</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-field microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td>Cell culture imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C2</td>
			<td>Immunofluorescence imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of retinoic acid-induced neural differentiation of mouse embryonic stem cells in two and three-dimensional embryoid bodies

Souris des cellules souches embryonnaires (CSE) isolées de la masse interne du blastocyste (typiquement à E3.5 jour), peut être utilisé comme système modèle in vitro pour étudier le développement embryonnaire précoce. En l&#39;absence de facteur inhibiteur de leucémie (LIF), CES différencient par défaut dans les cellules précurseurs neurales. Ils peuvent être amassés dans un agrégat sphérique en trois dimensions (3D) appelé corps embryoïdes (EB) en raison de sa similitude avec l&#39;embryon à un stade précoce. EB peuvent être ensemencées sur des lamelles revêtues de fibronectine, où ils se détendent en cultivant deux extensions dimensions (2D), ou implantés dans des matrices de collagène 3D où ils continuent de plus en plus sous forme de sphéroïdes, et se différencient en trois couches germinales: endodermique, mésodermique et ectodermique. La culture de collagène 3D imite l&#39;environnement in vivo plus près que la 2D SRU. La culture 2D EB facilite l&#39;analyse par immunofluorescence et immunoblot pour suivre la différenciation. Nous avons développé une differentia neuronale en deux étapesProtocole de tion. Dans la première étape, EBS sont générées par la technique de la goutte suspendue, et, simultanément, sont induites à se différencier par l&#39;exposition à l&#39;acide rétinoïque (RA). Dans la seconde étape, le produit de différenciation de neurones dans un format 2D ou 3D, en l&#39;absence de RA.

Oct4, Nanog, et SOX2 sont les facteurs de transcription de base qui confèrent ESC auto-renouvellement et la pluripotence. Nous avons appliqué le protocole ci - dessus pour comparer la différenciation neuronale des CES de type sauvage et d&#39;une souche de souris génétiquement modifiées où Syx, un gène codant pour le facteur d&#39;échange spécifique de RhoA Syx, est perturbé. Nous avions impliqués dans l&#39; angiogenèse Syx 18. Nous avons re...

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Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Nous décrivons une technique pour l&#39;utilisation de cellules souches embryonnaires de souris pour générer deux ou trois dimensions des corps embryoïdes. Nous expliquons alors comment induire la différenciation neuronale des cellules du corps embryoïdes par l&#39;acide rétinoïque, et comment analyser leur état de différenciation par immunofluorescence marqueur de cellules progénitrices et immunoblotting.

L&#39;analyse des rétinoïque induite par l&#39;acide Neuro-Différenciation de cellules souches embryonnaires de souris en deux et trois dimensions corps embryoïdes

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Découlant épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à partir de souches pluripotentes induites (iPS) de différentes tailles de corps embryoïdes

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Recherche

Biologie du développement

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Différenciation d&#39;un Neural Stem Cell humaine ligne sur Trois Cultures dimensionnelles, les gènes Analyse des microARN et Putative cibles

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Différenciation neurale des souris de cellules souches embryonnaires dans le sérum sans culture monocouche

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Régulation épigénétique de Cardiac Différenciation des cellules et tissus souches embryonnaires

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation

Prédiction et validation des éléments de réglementation gène activé Pendant l&#39;acide rétinoïque induit la différenciation des cellules souches embryonnaires

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Réalisé la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitif des cellules souches pluripotentes humaines

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontal Whole Mount: un protocole de traitement et d&#39;imagerie géniaux pour les sections transversales épaisses en tissu tridimensionnel

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rapide, réalisée la différenciation des cellules épithéliales pigmentaire rétinien de cellules souches pluripotentes humaines embryonnaires ou induit

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Génération d’insuline exempte d’échafaudage, en trois dimensions exprimant Pancreatoids de souris progéniteurs pancréatique In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Analyse de calcul de la lignée germinale de Caenorhabditis elegans pour étudier la Distribution des noyaux, les protéines et le cytosquelette

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...