Name: analysis of retinoic acid-induced neural differentiation of mouse embryonic stem cells in two and three-dimensional embryoid bodies
Uploaded: 2017-04-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies at JoVE.com

Это исследование было поддержано грантом NIH R01 HL119984 в AH

1. Культура мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) <ol><li> Подготовка MEF среды, среда Игла, модифицированная Eagle (DMEM, высокая глюкоза), с добавлением 15% бычьей эмбриональной сывороткой (FBS). </li><li> Coat 100 мм чашки для культивирования клеток с 0,5% -ным раствором желатина в течение 30 мин при комна?...

<ol>
	<li>Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiating+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies.">Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies.</a> Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).</li><li>Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+compromising+the+three+embryonic+germ+layers.">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers.</a> Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).</li><li>Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+embryoid+body+formation+and+hematopoietic+development+from+embryonic+stem+cells+in+different+culture+systems.">Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems.</a> Biotechnol Bioeng. 78 (4), 442-453 (2002).</li><li>Johansson, S., Svineng, G., Wennerberg, K., Armulik, A., Lohikangas, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-integrin+interactions.">Fibronectin-integrin interactions.</a> Front Biosci. 2, d126-d146 (1997).</li><li>Blumberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+retinoid+signaling+in+anteroposterior+neural+specification+and+neuronal+differentiation.">An essential role for retinoid signaling in anteroposterior neural specification and neuronal differentiation.</a> Semin Cell Dev Biol. 8 (4), 417-428 (1997).</li><li>Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoids+in+embryonal+development.">Retinoids in embryonal development.</a> Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).</li><li>Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+promotes+neural+and+represses+mesodermal+gene+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells+in+culture.">Retinoic acid promotes neural and represses mesodermal gene expression in mouse embryonic stem cells in culture.</a> Biochem Biophys Res Commun. 223 (3), 691-694 (1996).</li><li>Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic-acid-concentration-dependent+acquisition+of+neural+cell+identity+during+in+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Dev Biol. 275 (1), 124-142 (2004).</li><li>Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+synthesis+and+signaling+during+early+organogenesis.">Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis.</a> Cell. 134 (6), 921-931 (2008).</li><li>Niederreither, K., Dolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+in+development:+towards+an+integrated+view.">Retinoic acid in development: towards an integrated view.</a> Nat Rev Genet. 9 (7), 541-553 (2008).</li><li>Maden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+in+the+development,+regeneration+and+maintenance+of+the+nervous+system.">Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system.</a> Nat Rev Neurosci. 8 (10), 755-765 (2007).</li><li>Sheng, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+regulates+bone+morphogenic+protein+signal+duration+by+promoting+the+degradation+of+phosphorylated+Smad1.">Retinoic acid regulates bone morphogenic protein signal duration by promoting the degradation of phosphorylated Smad1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18886-18891 (2010).</li><li>Gajovic, S., St-Onge, L., Yokota, Y., Gruss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+mediates+Pax6+expression+during+in+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">Retinoic acid mediates Pax6 expression during in vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Differentiation. 62 (4), 187-192 (1997).</li><li>Dong, D., Ruuska, S. E., Levinthal, D. J., Noy, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+cellular+retinoic+acid-binding+proteins+I+and+II+in+regulating+signaling+by+retinoic+acid.">Distinct roles for cellular retinoic acid-binding proteins I and II in regulating signaling by retinoic acid.</a> J Biol Chem. 274 (34), 23695-23698 (1999).</li><li>Sessler, R. J., Noy, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ligand-activated+nuclear+localization+signal+in+cellular+retinoic+acid+binding+protein-II.">A ligand-activated nuclear localization signal in cellular retinoic acid binding protein-II.</a> Mol Cell. 18 (3), 343-353 (2005).</li><li>Tang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIRT1-Mediated+Deacetylation+of+CRABPII+Regulates+Cellular+Retinoic+Acid+Signaling+and+Modulates+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation.">SIRT1-Mediated Deacetylation of CRABPII Regulates Cellular Retinoic Acid Signaling and Modulates Embryonic Stem Cell Differentiation.</a> Mol Cell. 55 (6), 843-855 (2014).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+inhibits+neural+differentiation+in+murine+stem+cells+through+multiple+mechanisms.">RhoA inhibits neural differentiation in murine stem cells through multiple mechanisms.</a> Sci Signal. 9 (438), ra76 (2016).</li><li>Garnaas, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syx,+a+RhoA+guanine+exchange+factor,+is+essential+for+angiogenesis+in+Vivo.">Syx, a RhoA guanine exchange factor, is essential for angiogenesis in Vivo.</a> Circ Res. 103 (7), 710-716 (2008).</li><li>Chou, Y. H., Khuon, S., Herrmann, H., Goldman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin+promotes+the+phosphorylation-dependent+disassembly+of+vimentin+intermediate+filaments+during+mitosis.">Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis.</a> Mol Biol Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).</li><li>Arai, T., Matsumoto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+functionally+differentiated+microtubules+in+squid+neurons:+regional+distribution+of+microtubule-associated+proteins+and+beta-tubulin+isotypes.">Subcellular localization of functionally differentiated microtubules in squid neurons: regional distribution of microtubule-associated proteins and beta-tubulin isotypes.</a> J Neurochem. 51 (6), 1825-1838 (1988).</li><li>Arnhold, S., Klein, H., Semkova, I., Addicks, K., Schraermeyer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurally+selected+embryonic+stem+cells+induce+tumor+formation+after+long-term+survival+following+engraftment+into+the+subretinal+space.">Neurally selected embryonic stem cells induce tumor formation after long-term survival following engraftment into the subretinal space.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (12), 4251-4255 (2004).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+receptor+beta+mediates+the+growth-inhibitory+effect+of+retinoic+acid+by+promoting+apoptosis+in+human+breast+cancer+cells.">Retinoic acid receptor beta mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in human breast cancer cells.</a> Mol Cell Biol. 16 (3), 1138-1149 (1996).</li><li>Altucci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-induced+apoptosis+in+leukemia+cells+is+mediated+by+paracrine+action+of+tumor-selective+death+ligand+TRAIL.">Retinoic acid-induced apoptosis in leukemia cells is mediated by paracrine action of tumor-selective death ligand TRAIL.</a> Nat Med. 7 (6), 680-686 (2001).</li><li>Pettersson, F., Dalgleish, A. G., Bissonnette, R. P., Colston, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoids+cause+apoptosis+in+pancreatic+cancer+cells+via+activation+of+RAR-gamma+and+altered+expression+of+Bcl-2/Bax.">Retinoids cause apoptosis in pancreatic cancer cells via activation of RAR-gamma and altered expression of Bcl-2/Bax.</a> Br J Cancer. 87 (5), 555-561 (2002).</li><li>Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+matrix+microenvironment+for+targeted+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+neural+and+glial+lineages.">3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages.</a> Biomaterials. 34 (25), 5995-6007 (2013).</li><li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+and+TGF-beta+pathway+mediators+are+critical+upstream+regulators+of+Wnt+signaling+during+midbrain+dopamine+differentiation+in+human+pluripotent+stem+cells.">BMP and TGF-beta pathway mediators are critical upstream regulators of Wnt signaling during midbrain dopamine differentiation in human pluripotent stem cells.</a> Dev Biol. 376 (1), 62-73 (2013).</li></ol>

В этом протоколе мы представляем относительно простой и доступный метод для изучения нейронной дифференцировки мышиных ЭСК. В предыдущих протоколах, РА был добавлен в среду в день 2 или 4 -й день в EB-висячей капли 8 или суспензионной культуры 7, соответственно, и?...

ЭСК происходит из бластоцисты внутренней клеточной массы. Эти клетки плюрипотентные, то есть они обладают способностью дифференцироваться в любой тип клеток организма происхождения. ESC дифференцировки в пробирке имеет широкий интерес в качестве экспериментальной системы для исследования путей и механизмов развития. Он предлагает мощную и гибкую систему модели для тестирования новых терапевтических подходов для коррекции клеточной и тканевой дисфункции. ЭТ резюмировать многие аспекты дифференцировки клеток на ранних стадиях эмбриогенеза. В частности, ЭТ может быть использован , когда эмбриональная летальность делает его трудно определить клеточную основу эмбриональных дефектов 1, 2. ЭТ может быть образован либо за счет висячей капли или жидких методов подвески 3. Преимущество первого является способность генерировать ЭТ последовательного размера и плотности, что облегчает экспериментальную воспроизводимость. <p cдеваха = «jove_content»&gt; Взаимодействие с внеклеточным матриксом (ECM) белков адгезии может повлиять на подвижность и выживание адгезивных клеток. В системе культуры 2D, фибронектин часто применяются для увеличения адгезии клеток с субстратом. Фибронектина является базальной пластинкой компонент распознается 10 типов клеточной поверхности интегрин гетеродимеров 4. РА представляет собой небольшой липофильный метаболит витамина А , который индуцирует дифференцировку нейронную 5, 6. Высокие концентрации RA способствуют экспрессии генов и нейронную репрессирует экспрессию гена мезодермального в процессе формирования EB 7, 8. РА получают путем окисления витамина А , чтобы ретинальдегида либо спиртом или ретинола дегидрогеназы, с последующим окислением ретинальдегида до конечного продукта с помощью ретинальдегида дегидрогеназы 9. Нейронная дифференциация требует транспорта РА из цитоплазмы<html> к ядру с помощью клеточного белка РА-2 (связывание CRABP2). В ядре РА связывается с родственным рецепторным комплексом , состоящим из гетеродимер RAR-RXR 10. Это приводит к тому набору транскрипционных ко-активаторы и инициации транскрипции 9, 11. Кроме того, РА способствует деградации фосфорилированного (активной) Smad1, таким образом антагонизма BMP и СМАД сигнализации 12. В дополнение к этим деятельности, РА повышает экспрессию Pax6, фактор транскрипции , который поддерживает нейронную дифференциацию 13. Сигнализации РА модулируется Sirtuin-1 (Sirt1), ядерным никотинамидадениндинуклеотид (НАД +) - зависимый фермент , который деацетилирует CRABP2, препятствуя его транслокацию в ядро, и , следовательно , с РА связывания с RAR-RXR гетеродимер 14, 15, 16. e_content &quot;&gt; Наша цель при разработке RA-обработанную протокол EB , описанный здесь , чтобы оптимизировать нейронную дифференциацию для того , чтобы облегчить анализ витро сигнальных путей , которые регулируют ESC дифференцировку в нейрональные клетки - предшественники. Одним из преимуществ этого протокола является содействие анализ функции клеток с помощью иммунофлюоресценции. 3D ЭТ не хорошо проникает антитела и их трудно изображение. EB диссоциации в 2D монослой в определенные моменты времени в ходе дифференцировка нервная облегчает иммунноокрашивание и визуализацию клеток с помощью конфокальной микроскопии.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEFs</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PMEF-CF</td>
			<td>ESC feeder layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESC</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CMTI-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (60 mm)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30701119</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (100 mm)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td>Hanging drops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td>2D EBs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30720113</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark 1.5 ml centrifuge tube</td>
			<td>Celltreat Scientific Products</td>
			<td>229437</td>
			<td>RA stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover-glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td>Circular, 12 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost-plus microscope slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D collagen culture kit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ECM675</td>
			<td>3D culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Effectene Transfection Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>301427</td>
			<td>Stem cell transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcon&#160;Centrifugal Filters (10 kDa)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>MRCPRT010</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-709F</td>
			<td>MEFs culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440-046</td>
			<td>ESCs culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ES-009-B</td>
			<td>ESCs culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2625</td>
			<td>Dish coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>8878-LF-025</td>
			<td>To maintain ESC pluripotency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solutions</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750060</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoZap Plus-PR</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VZA-2022</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans-retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td>Induction of neural differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030-50G</td>
			<td>Blocking and antibody dilution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td>Cell membrane permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI</td>
			<td>Life Tech.</td>
			<td>P36931</td>
			<td>Mounting reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1030-FN</td>
			<td>Dish coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Worthington Biochem. Corp</td>
			<td>LS004196</td>
			<td>EB dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Primary Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin (Rat-401)</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-33677</td>
			<td>Detection of neural differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct4</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-5279</td>
			<td>Detection of neural differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanog</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-398A</td>
			<td>Detection of neural differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3579</td>
			<td>Detection of neural differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin b3 (AA10)</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-80016</td>
			<td>Detection of neural differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Secondary Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse-Alexa555</td>
			<td>Life Tech.</td>
			<td>A31570</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse-Alexa488&#160;</td>
			<td>Life Tech.</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-field microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td>Cell culture imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C2</td>
			<td>Immunofluorescence imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of retinoic acid-induced neural differentiation of mouse embryonic stem cells in two and three-dimensional embryoid bodies

Мышиные эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) , выделенные из внутренней массы бластоцисты (обычно в день E3.5), может быть использован как в пробирке модельной системы для изучения раннего эмбрионального развития. При отсутствии фактора ингибирования лейкемии (LIF), ЭСК дифференцируются по умолчанию в клетки нервных предшественников. Они могут быть накопили в трехмерной (3D) сферический агрегат называется эмбриональное тело (EB) из-за его сходство с ранней стадией эмбриона. ЭТ может быть высевал на фибронектин покрытия покровных, где они расширяются путем выращивания двумерный (2D) расширений, или имплантированный в 3D-матрицах коллагена, где они продолжают расти, как сфероиды и дифференцируются в трех зародышевых слои: эндодермы, мезодермальную и эктодермальных. 3D коллаген культура имитирует среду в естественных условиях более тесно , чем 2D ЭТ. Культура 2D EB облегчает анализ иммунофлюоресценции и иммуноблоттингом для отслеживания дифференциации. Мы разработали два этапа нейронные отличительныеПротокол Тион. На первом этапе, ЭТ генерируются с помощью метода висячей капле, и, одновременно, индуцируются дифференцироваться под воздействием ретиноевой кислоты (RA). На втором этапе, нейронная дифференциация протекает в формате 2D или 3D в отсутствии RA.

Oct4, Nanog и SOX2 являются основными факторами транскрипции, которые придают ESC самообновлению и плюрипотентности. Мы применили вышеуказанный протокол для сравнения нейронную дифференцировку ЭСК от дикого типа и от штамма генетически модифицированных мышей , где Syx, г...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies at JoVE.com

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Опишем методику с использованием мышиных эмбриональных стволовых клеток для создания двух или трех размерных эмбриональных телец. Затем мы объясним, как вызывать нейронную дифференцировку эмбриональных клеток организма с помощью ретиноевой кислоты, и как анализировать их состояние дифференцировки клеток-предшественников иммунофлюоресценцией маркеров и иммуноблоттингом.

Анализ ретиноевой кислоты-индуцированной Neural дифференциации эмбриональных стволовых клеток мыши в двух и трех-мерных эмбриональных телец

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

The overall goal of this procedure is to analyze the expression and production of genes and protein markers, respectively, of neural differentiation of mouse embryonic stem cells. This method can help determine the mechanism responsible for the inhibition of neural differentiation by the raw age of DPAs, and lead to better protocols to differentiate stem cells into neurons for therapeutic purposes. The main advantage of this technique is that it facilitates tracking the process of neural differentiation at the emerin and protein levels, including by optical microscopy.Demonstrating the procedure will be Dr.Junning Yang, a research associate in my laboratory. Begin embryoid body formation by harvesting embryonic stem cells with 0.25%Trypsin-EDTA for two to five minutes at 37 degrees celsius, 5%carbon dioxide. Add fresh Iscove's Modified Dulbecco's Medium, or IMDM, with 15%FBS to the detaching cells, and transfer the cell suspension to a 15 milliliter tube.Centrifuge at 160 x G for five minutes at room temperature. Then count the cells using a hemocytometer, and prepare a five x 10 to the fifth cells per milliliter suspension in IMDM with 0.5 micromolar retinoic acid. Next, use an eight-channel pipette and 200-microliter tips to plate 120-microliter drops per 100 millimeter petri dish.Invert the dish and fill the inverted lid with PBS to prevent hanging drops from drying. Culture at 37 degrees celsius, 5%carbon dioxide, for three to four days. Use 200-microliter pipette tips to harvest hanging drop embryoid bodies grown for three days.Touch an embryoid body with a pipette tip, and transfer it to a fibernectin-coated cover slip in a 24-well plate. Change the medium on the cultures every two to three days. When changing the medium, collect the used medium for protein secretion analysis as needed.To detect secreted proteins in the medium, transfer 500 microliters of embryoid body medium to 10 kilodalton cutoff centrifugal filters, and spin at 20, 000 x G at four degrees celsius. Examine the medium remaining inside the centrifugal filters every 15 to 20 minutes to prevent excessive enrichment. Stop centrifugation when the volume of the remaining medium has fallen to 25 microliters.Invert the filter and spin at 160 x G at four degrees celsius, then collect the remaining concentrated medium by following the manufacturer's instructions. For a 3D culture, harvest embryoid bodies grown for four days as hanging drops with 200-microliter pipette tips, as before. Transfer 30 embryoid bodies to a 1.5 milliliter centrifuge tube, then prepare collagen gel solution by diluting appropriate volumes of collagen solution and 5X DMEM, adding the neutralization solution, and immediately mixing well.Place the collagen gel on ice. Next, pipette an appropriate volume of chilled collagen solution into the tube containing the embryoid bodies, and then gently pipette the embryoid body suspension into the wells of a six-well plate without creating bubbles. Immediately transfer the plate to 37 degrees celsius, 5%carbon dioxide, for 60 minutes to initiate collagen polymerization.After the 60 minutes, overlay the plate containing the embryoid bodies with IMDM. For embryoid body dissociation, again collect the four-day hanging drop embryoid bodies with 200-microliter pipette tips. This time, transfer them to a non-adhesive bacteriological petri dish containing IMDM with 15%FBS and culture at 37 degrees celsius, 5%carbon dioxide, for four more days.Check the embryoid bodies twice every day to make sure they do not attach to the bottom. Gently shake the dish to prevent embryoid body attachment. After four days, transfer the embryoid bodies to a centrifuge tube and centrifuge at 185 x G for five minutes at room temperature.Following centrifugation, remove the supernatant. The palette volume should not exceed 100 microliters. Next, pipette one milliliter of 0.25%type I collagenase, supplemented with 20%FBS in PBS into the tube of embryoid bodies.Incubate the mixture for one hour at 37 degrees celsius and 5%carbon dioxide. Gently pipette the suspension using a one-milliliter pipette tip every 20 minutes. After the incubation, gently wash the cells three times with PBS.If cell aggregates are present, use a cell strainer with a 100-micron mesh to remove them. Plate the cells on gelatin-coated cover slips in IMDM, then incubate at 37 degrees celsius and 5%carbon dioxide. Wash the 2D or dissociated 3D embryoid bodies with PBS.Then fix with four percent paraformaldehyde and PBS for 30 minutes at room temperature. After washing the fixed cells three times with PBS to remove floating cell debris, add 1%triton X-100 in PBS to permeabilize the cells for 20 minutes at room temperature. After washing as before, remove the last wash and block with 5%BSA in PBS for 30 minutes.Towards the end of the incubation, prepare a primary antibody dillution in 1%BSA in PBS supplemented with 0.03%triton X-100. When the 30 minutes has elapsed, replace the blocking solution with the primary antibody solution. Incubate for three hours at room temperature, or overnight, at four degrees celsius.After washing, apply a secondary antibody in PBS and incubate for one hour at room temperature. Finally, mount cover slips on glass slides with an anti-fade medium for optical microscopy. This image shows sprout emergence from an embryoid body generated from ESCs, positive for two copies of the Syx gene, which codes for a guanine exchange factor that activates the GTPase RhoA.The image was taken after six days in 3D culture. This embryoid body formed from Syx KnockOut ESCs demonstrates increased sprouting after the same time in culture. Here, phase images of 2D embryoid body edges show that cells expanded faster from Syx KnockOuts than from Syx wild-type.These immunofluorescence images illustrate that the neural differentiation marker, Nestin, shown in red, was more abundant in cells expanding from six-day 2D6 KnockOut embryoid bodies than from their Syx wild-type counterparts. Here, immunofluorescence images show that the neural differentiation markers Nestin and beta III Tubulin were more abundant in cells dissociated from 13-day 3D6 KnockOut embryoid bodies than from their Syx wild-type counterparts. This is a time-consuming procedure because of the duration of embryoid body growth and differentiation.It not only requires at least eight days, but in some cases we follow differentiation up to 24 days. While attempting this procedure, it is important to remember to limit the viability of embryoid body diameter to ensure similar differentiation rates along the embryoid bodies.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

ОТВЕТСТВЕННОСТЬ пигментного эпителия сетчатки (НПП) и из индуцированных плюрипотентных стволовых (IPS) клетки по-разному размеры эмбриональных телец

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Дифференциация человеческих нервных стволовых клеток линии на трехмерной культур, анализ микроРНК и предполагаемые гены-мишени

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Дифференциация нейронных эмбриональных стволовых клеток мыши в бессывороточной монослоя культуры

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Эпигенетическое регуляции сердечной дифференциации эмбриональных стволовых клеток и тканей

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation

Прогнозирование и проверка элементов гена регуляторной Активированный Во время ретиноевой кислоты индуцированных эмбриональных стволовых дифференцировка клеток

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Горизонтальная целая гора: новый протокол обработки и обработки изображений для толстых, трехмерных поперечных сечений кожи

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Быстрое, режиссер дифференциация клеток эпителия сетчатки пигмента от человеческого эмбриона или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Поколение эшафот бесплатно, трехмерные инсулина выражая Pancreatoids от мыши поджелудочной железы прародителями в пробирке

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Вычислительный анализ микрофлорой Caenorhabditis elegans для изучения распределения ядер, белки и Цитоскелет

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Поколения клеток человека первичных зародышевых клеток как на поверхности Embryoid органов от загрунтовать плюрипотентности индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...