Name: high precision fret at single-molecule level for biomolecule structure determination
Uploaded: 2017-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination at JoVE.com

فج و هس تقر الدعم من المعاهد الوطنية للصحة R01 GM094246 إلى فج. ويقر هس بأموال البدء من برنامج كليمان للتحقيق الإبداعي التابع لجامعة كليمسون ومركز علوم المواد البصرية والتكنولوجيا الهندسية في جامعة كليمسون. كما تم دعم هذا المشروع من خلال زمالة التدريب من مركز كيك للتدريب متعدد التخصصات العلوم البيولوجية لاتحاد ساحل الخليج (نيغمس منحة رقم 1 T32GM089657-05) وزمالة مؤسسة شيسلر للدراسات الانتقالية من الأمراض البشرية المشتركة ل د. المحتوى هو فقط من مسؤولية المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

1. برنامج تلفزيوني العازلة إعداد وغرفة العلاج ملاحظة: ارتداء معطف المختبر والقفازات التي يمكن التخلص منها عند إجراء التجارب الكيميائية الرطبة. استخدام حماية العين عند محاذاة الليزر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction...

في هذا العمل، يتم تقديم بروتوكول لمحاذاة ومعايرة وقياس المسافات إنتيردي مع دقة عالية باستخدام بيي-مفد جزيئات جزيء واحد التجارب. من خلال معايرة بعناية جميع المعلمات مفيدة، يمكن للمرء أن يزيد من دقة المسافات المقاسة والوصول إلى دقة أنجستروم. ولتحقيق ذلك، تستخدم مختلف...

والهدف الأساسي للدراسات البيولوجيا الهيكلية هو كشف العلاقة بين هيكل ووظيفة الآلات الجزيئية الحيوية. حدث الانطباع البصري الأول من الجزيئات الحيوية (على سبيل المثال، البروتينات والأحماض النووية) في 1950s من خلال تطوير البلورات بالأشعة السينية 1 ، 2 . يوفر البلورات بالأشعة السينية عالية الدقة، معلومات هيكلية ثابتة مقيدة التعبئة الكريستال. ولذلك، فإن الجمود الكامنة للنماذج الهيكلية الأشعة السينية يغير الطبيعة الديناميكية للجزيئات الحيوية، وهو عامل يؤثر على معظم الوظائف البيولوجية 3 ، 4 ، 5 . الرنين المغناطيسي النووي (نمر) 6 ، 7 ، 8 قدمت حلا بديلا للمشكلة من خلال حل النماذج الهيكلية في المحاليل المائية. وهناك ميزة كبيرةمن الرنين المغناطيسي النووي هو قدرته على استعادة الطبيعة الديناميكية الجوهرية للجزيئات الحيوية والفرق التوافقية، مما يساعد على توضيح العلاقات الجوهرية بين الهيكل والديناميات والوظيفة 3 ، 4 ، 5 . ومع ذلك، فإن الرنين المغناطيسي النووي، مقيدا بحجم العينة وكميات كبيرة من العينة، يتطلب استراتيجيات وضع العلامات المعقدة للنظم الأكبر حجما. لذلك، هناك حاجة ملحة لتطوير طرق بديلة في البيولوجيا الهيكلية. تاريخيا، فورستر نقل الطاقة الرنين (فريت) 9 لم تأخذ دورا هاما في البيولوجيا الهيكلية بسبب سوء فهم أن الحنق يوفر قياسات المسافة منخفضة الدقة. هذا هو الغرض من هذا البروتوكول لإعادة النظر في قدرة الحنق لتحديد المسافات على نطاق نانومتر، بحيث يمكن استخدام هذه المسافات لبناء نماذج هيكلية من الجزيئات الحيوية. أول التحقق التجريبيأتيون من R - 6 الاعتماد على كفاءة فريت تم القيام به من قبل ستراير في عام 1967 10 من خلال قياس بوليبرولينس من أطوال مختلفة باسم &quot;حاكم الطيفي.&quot; وقد أجريت تجربة مماثلة على مستوى الجزيء الواحد في عام 2005 11 . تحولت جزيئات بوليبرولين إلى أن تكون غير مثالية، وبالتالي، تم استخدام جزيئات الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل في وقت لاحق 12 . هذا فتح نافذة لقياس المسافة دقيقة وفكرة استخدام الحنق لتحديد الخصائص الهيكلية للجزيئات الحيوية. الحنق هو الأمثل عندما يكون نطاق المسافة إنتيردي من ~ 0.6-1.3 R 0 ، حيث R 0 هو المسافة فورستر. ل فلوروفوريس نموذجية المستخدمة في التجارب جزيء واحد جزيء، R 0 هو ~ 50 Å. عادة، فريت يقدم العديد من المزايا على طرق أخرى في قدرته على حل والتمييز بين الهياكل والديناميات فيأنظمة غير متجانسة: (1) نظرا للحساسية في نهاية المطاف من مضان، جزيء واحد تجارب فريت 13 ، 14 ، 15 ، 16 يمكن حل الفرق غير متجانسة عن طريق العد مباشرة وفي الوقت نفسه تميز هياكل أفرادها. (2) يمكن فك رموز مسارات التفاعل المعقدة مباشرة في دراسات فريت ذات الجزيء الواحد لأنه لا حاجة إلى تزامن مجموعة. (3) يمكن أن الحنق الوصول إلى مجموعة واسعة من المجالات الزمنية التي تمتد على مدى 10 عقود في الوقت المناسب، تغطي مجموعة واسعة من الديناميات ذات الصلة بيولوجيا. (4) التجارب فريت يمكن أن يؤديها في أي ظروف الحل، في المختبر وكذلك في الجسم الحي . الجمع بين الحنق مع المجهر مضان يسمح لدراسة الهياكل الجزيئية والتفاعلات مباشرة في الخلايا الحية 15 ، 16 ، </<html> سوب&gt; 17 ، 18 ، 19 ، حتى مع دقة عالية 20 . (v) الحنق يمكن تطبيقها على أنظمة ما يقرب من أي حجم (على سبيل المثال، بوليغرولين أوليغوميرس 21 ، 22 ، 23 ، 24 ، Hsp90 25 ، فيروس نقص المناعة البشرية النسخ العكسي 26 ، وريبوسوم 27 ). (6) وأخيرا، يمكن استخدام شبكة من المسافات التي تحتوي على كل الأبعاد للجزيئات الحيوية لاستخلاص نماذج هيكلية من جزيئات ثابتة أو ديناميكية 18 ، 28 ، 29 ، 30 ، 31 ، 32 ، 33 ، 34 ،ريف &quot;&gt; 35 ، 36 ، 37 . لذلك، يمكن استخدام طيفي جزيء واحد جزيء لاستخلاص المسافات التي هي دقيقة بما فيه الكفاية لاستخدامها للنمذجة الهيكلية مقيدة المسافة 26 . هذا ممكن من خلال الاستفادة من كشف مضان متعدد المسافات (مفد) 28 ، 38 ، 39 ، 40 ، 41 ، 42 ، والذي يستخدم ثمانية أبعاد المعلومات مضان ( أي الطيف الإثارة، طيف مضان، متباين الخواص، ومضان عمر، والوقت المجهري، وشدة مضان، والمسافة بين فلوروفوريس) بدقة وبدقة توفير قيود المسافة. بالإضافة إلى ذلك، يتم الجمع بين الإثارة المشذرة نابض (بيي) مع مفد(بيي-مفد) 42 لرصد مضان متقبل الإثارة المباشرة واختيار أحداث جزيء واحد الناشئة عن العينات التي تحتوي على 1: 1 مانولوجي إلى متقبل الكيمياء المتكافئة. يستخدم إعداد بيي-مفد نموذجي ليزر نابض مشع اثنان متصلا بجهاز المجهر متحد البؤر، حيث يتم تقسيم الكشف الفوتون إلى أربع قنوات مختلفة في مختلف النوافذ الطيفية وخصائص الاستقطاب. مزيد من التفاصيل يمكن العثور عليها في الشكل 1 . من المهم أن نلاحظ أن الحنق يجب أن تكون جنبا إلى جنب مع الأساليب الحسابية لتحقيق النماذج الهيكلية مثل ذري التي تتفق مع النتائج الحنق 26 ، 30 . ليس الهدف من هذا البروتوكول للذهاب أكثر من المنهجية المرتبطة لبناء نماذج هيكلية مع المسافات المشتقة من الحنق. ومع ذلك، تم تطبيق هذه النهج جنبا إلى جنب مع تقنيات أخرى (على سبيل المثال، زاوية صغيرة مبعثر الأشعة السينيةإنغ أو إلكترون باراماجنيتيك الرنين)، ولادة مجال البيولوجيا الهيكلية التكاملي 43 ، 44 ، 45 ، 46 . الهدف الحالي هو تمهيد الطريق ل الحنق كأداة كمية في علم الأحياء الهيكلي. على سبيل المثال، تم استخدام هذه المنهجية لتحديد ثلاث حالات مطابقة في مجال الربط يجند (لبد) لمستقبل N-ميثيل-D-أسبارتات (نمدا). والهدف النهائي هو التغلب على القيود المذكورة أعلاه وتقديم فريت بين أساليب التكامل المستخدمة لتحديد الهيكلية من الجزيئات الحيوية من خلال توفير مسافات قياسها مع دقة عالية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">charcoal</td>
			<td style="width:183px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:119px;">K42964486 320</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">syringe filter</td>
			<td style="width:183px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">09-719C</td>
			<td>size: 0.20um</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">chambered coverglass</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">155409</td>
			<td>1.5 borosilicate glass, 8 wells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">microscope cover glass</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">063014-9</td>
			<td>size: 24X60-1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">148859</td>
			<td>nuclease free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">tween-20</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28320</td>
			<td>10% solution of Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">acceptor DNA strand (High FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">178124895</td>
			<td>5&#180;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">acceptor DNA strand (Low FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">177956424</td>
			<td>5&#180;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">donor DNA strand</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">177951437</td>
			<td>5&#180; -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">DNA strand (No FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>5&#180; -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">thermal cycler</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">E6331000025</td>
			<td>nexus gradient</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Alexa Fluor 488 C5&#160;Maleimide</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A10254</td>
			<td>termed cyan-green fluorophore in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Alexa Fluor 647 C2&#160;Maleimide</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A20347</td>
			<td>termed far-red fluorophore in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Rhodamine 110</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83695-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Rhodamine 101</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83694-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1426</td>
			<td>For culture of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A0166</td>
			<td>Used at 100 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Tetracyline&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">58346</td>
			<td>Used at 12.5 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP906-5</td>
			<td>Used at 15 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Origami B(DE3) Competent Cells</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">70837-3</td>
			<td>Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1755</td>
			<td>For induction of E. coli protein expression</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">HiTrap Chelating HP</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0409-01</td>
			<td>For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Imidazole</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">56749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Ni-NTA Agarose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PD-10 Desalting Column</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">AktaPurifier</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28406264</td>
			<td>FPLC Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Dialysis tubing</td>
			<td style="width:183px;">Spectrum labs</td>
			<td style="width:119px;">132562</td>
			<td>15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Dichroics</td>
			<td style="width:183px;">Semrock</td>
			<td style="width:119px;">FF500/646-Di01-25x36</td>
			<td>500/646 BrightLight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">50/50 Beam splitter polarizer</td>
			<td style="width:183px;">Qioptiq Linos&#160;</td>
			<td style="width:119px;">G33 5743 000</td>
			<td>10x10 film polarizer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Green pass filer</td>
			<td style="width:183px;">Chroma</td>
			<td style="width:119px;">ET525/50m</td>
			<td style="width:167px;">ET525/50m 25 mm diameter mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Red pass filter</td>
			<td style="width:183px;">Chroma</td>
			<td>ET720/150m</td>
			<td>ET720/150m 25 mm diameter mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Power Meter</td>
			<td style="width:183px;">ThorLabd</td>
			<td style="width:119px;">PM200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:183px;">Varian</td>
			<td style="width:119px;">Cary300Bio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fluorolog 3 fluorometer</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">FL3-22-R3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fluorohub TCSPC controller</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">Fluorohub-B</td>
			<td>TCSPC electronics for ensemble measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">NanoLed 485L</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">485L</td>
			<td>Blue diode laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">NanoLed 635L</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">635L</td>
			<td>Red diode laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Olympus IX73 Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX73P2F</td>
			<td>Microscope frame</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PMA 40 Hybrid Detector</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">932200, PMA 40</td>
			<td>Optimized for green detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PMA 50 Hybrid Detector</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">932201, PMA 50</td>
			<td>Optimized for ed shifter sensitivity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">485nm laser</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">LDH-D-C-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">640nm laser</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">LDH-D-C-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Hydraharp 400 and TTTR acqusition software</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant</td>
			<td align="right" style="width:119px;">930021</td>
			<td>Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">SEPIA II SLM 828 and SEPIA software</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant</td>
			<td align="right" style="width:119px;">910028</td>
			<td>Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">computer</td>
			<td style="width:183px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">optiplex 7010</td>
			<td>cpu: i7-3770 ram:16GB</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">FRET Positioning and Screening (FPS) software</td>
			<td style="width:183px;">Heinrich Heine Unviersity</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">MFD suite</td>
			<td style="width:183px;">Heinrich Heine Unviersity</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high precision fret at single-molecule level for biomolecule structure determination

ويرد هنا بروتوكول عن كيفية إجراء قياسات لمسافات بينية عالية الدقة باستخدام نقل الطاقة بالرنين فورستر (فريت) على مستوى الجزيء الواحد في أسلوب كشف مضان متعدد المسافات (مفد). مفد يزيد من استخدام جميع &quot;أبعاد&quot; مضان للحد من التحف الضوئية والتجريبية ويسمح لقياس المسافة إنتيردي مع دقة تصل إلى ~ 1 Å في الجزيئات الحيوية جامدة. واستخدمت هذه الطريقة لتحديد ثلاث حالات تطابقية في مجال ربط يجند لمستقبل N-ميثيل-D-أسبارتات (نمدا) لشرح تفعيل المستقبل عند ربط يجند. عند مقارنة الهياكل البلورية المعروفة مع القياسات التجريبية، وافقوا في أقل من 3 Å للحصول على جزيئات حيوية أكثر ديناميكية. جمع مجموعة من القيود عن بعد التي تغطي الأبعاد كاملة من الجزيئات الحيوية من شأنه أن يجعل من الممكن لتوفير نموذج هيكلي لل بيومولكول الحيويوفاق.

في تجارب سمفريت نموذجية باستخدام إعداد مفد (خطوط ليزر: 485 نانومتر في 60 μW و 640 نانومتر في 23 μW، القسم 5.1)، يتم تخفيف عينة مضان إلى تركيز منخفض بيكومولار (10 -12 M = 1 بم) وضعت في المجهر متحد البؤر، حيث نبض الليزر نانو ثانية الثانية تثير جزيئات المسمى بحر?...

Watch this Scientific Journal Video about High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination at JoVE.com

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

ويرد هنا بروتوكول للتجارب الحنق عالية الدقة على مستوى جزيء واحد. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه المنهجية لتحديد ثلاث حالات مطابقة في مجال الربط يجند من مستقبلات N-ميثيل-D-أسبارتاتي (نمدا). تحديد مسافات دقيقة هي الخطوة الأولى نحو بناء النماذج الهيكلية على أساس التجارب فريت.

عالية الدقة حنق في مستوى جزيء واحد لجزيء الجزيئي تحديد هيكل

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

معلومات الهيكلية من جزيء واحدة الحنق التجارب باستخدام سريع نانو لتحديد المواقع نظام

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

جزيء واحد بسيطة وقوية وعالية إنتاجية تدفق تمتد مقايسة التنفيذ لدراسة نقل جزيئات على طول الحمض النووي

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

التلاعب جزيء واحد من كوادروبليكسيس ز بملاقط مغناطيسية

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

إنتاجية عالية، وتحديد محتوى البروتين المحددة في مستويات الأنسجة باستخدام نقطة الكمية المطلقة لطخة تحليل (قدب)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

استخدام ألوان جزيء واحد الحنق لدراسة الترابط بين تفاعلات البروتين

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

تجميد التساهمية من البروتينات للتحليل الطيفي قوة جزيء واحد

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

تحليل خلية واحدة من الأليل النشطة نسخيا بواسطة جزيء واحد FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

إجراء قياسات دقيقة ودقيقة أحادية الجزيء FRET باستخدام smfBox مفتوح المصدر

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

التصوير أحادي الجزيء لتجميع مكثفات EWS-FLI1 على الحمض النووي

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...