Name: high precision fret at single-molecule level for biomolecule structure determination
Uploaded: 2017-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination at JoVE.com

VJ og HS anerkender støtte fra NIH R01 GM094246 til VJ. HS anerkender startfonde fra Clemson University Creative Research Program og Center for Optical Materials Science and Engineering Technologies på Clemson University. Dette projekt blev også støttet af et træningsfællesskab fra Keck Center for Tværfaglig Bioscience Training af Gulf Coast Consortia (NIGMS Grant No. 1 T32GM089657-05) og Schissler Foundation Fellowship for Translational Studies of Common Human Diseases til DD. Indholdet er udelukkende forfatterens ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.

1. PBS buffer forberedelse og kammerbehandling BEMÆRK: Brug et laboratoriejakke og engangshandsker, når der udføres våde kemiske forsøg. Brug øjenbeskyttelse, når du justerer laseren. <ol><li> PBS buffer forberedelse <ol><li> Opløs 4,5 g Na2HP04, 0,44 g NaH2P04 og 3,5 g NaCl i 400 ml destilleret vand. Sørg for en pH på 7,5 og steriliser opløsningen ved autoklavering i en væskecyklus i 1 time (afhængigt af autoklavsystemet). </li><li> Tag 15 ml af PBS-opløsnin...

I dette arbejde præsenteres protokollen til justering, kalibrering og måling af interdyeafstande med høj præcision ved brug af PIE-MFD-enkeltmolekylære FRET-eksperimenter. Ved omhyggeligt at kalibrere alle instrumentelle parametre kan man øge nøjagtigheden af ​​de målte afstande og nå Angstrom-nøjagtighed. For at gøre det bruges forskellige multidimensionale histogrammer til at analysere og identificere populationer til yderligere karakterisering. Ved hjælp af den gennemsnitlige makro tid for at verifice...

Et grundlæggende mål for strukturelle biologistudier er at ophæve forholdet mellem biomolekylære maskineres struktur og funktion. Det første visuelle indtryk af biomolekyler ( fx proteiner og nukleinsyrer) forekom i 1950&#39;erne gennem udvikling af røntgenkrystallografi 1 , 2 . Røntgenkrystallografi giver høj opløsning, statisk strukturel information, der er begrænset af krystalpakningen. Derfor skinner den iboende immobilitet af røntgenstrukturelle modeller biomolekylernes dynamiske natur, en faktor der påvirker de fleste biologiske funktioner 3 , 4 , 5 . Kernemagnetisk resonans (NMR) 6 , 7 , 8 tilvejebragte en alternativ løsning på problemet ved at løse strukturelle modeller i vandige opløsninger. En stor fordelAf NMR er dets evne til at genvinde den indre dynamiske natur af biomolekyler og konformationelle ensembler, hvilket hjælper med at afklare de indbyrdes forhold mellem struktur, dynamik og funktion 3 , 4 , 5 . Ikke desto mindre kræver NMR, begrænset af prøvestørrelse og store mængder af prøve, komplekse mærkningsstrategier for større systemer. Derfor er der et presserende behov for at udvikle alternative metoder inden for strukturbiologi. Historisk har Forster-resonansenergioverførsel (FRET) 9 ikke taget en vigtig rolle i strukturbiologi på grund af den misforståelse, at FRET giver målinger med lav nøjagtighed. Formålet med denne protokol er at revidere FRETs evne til at bestemme afstande på nanometer skalaen, således at disse afstande kan anvendes til opbygning af strukturelle modeller af biomolekyler. Den første eksperimentelle verifikationAtion af R - 6 afhængigheden af ​​FRET effektiviteten blev udført af Stryer i 1967 10 ved måling af polyproliner af forskellige længder som en &quot;spektroskopisk lineal&quot;. Et lignende eksperiment blev udført på enkeltmolekyleniveau i 2005 11 . Polyprolinmolekyler viste sig at være ikke-ideelle, og således blev dobbeltstrengede DNA-molekyler senere anvendt 12 . Dette åbnede vinduet for præcise afstandsmålinger og ideen om at bruge FRET til at identificere strukturelle egenskaber hos biomolekyler. FRET er optimal, når interdyeafstanden er fra ~ 0,6-1,3 R 0 , hvor R 0 er Förster-afstanden. For typiske fluoroforer, der anvendes i single-molekyle FRET-eksperimenter, er R0 ~ 50 Å. FRET tilbyder typisk mange fordele i forhold til andre metoder i sin evne til at løse og differentiere strukturer og dynamik iHeterogene systemer: (i) På grund af den ultimative følsomhed af fluorescens kan enkeltmolekylære FRET-eksperimenter 13 , 14 , 15 , 16 løse heterogene ensembler ved direkte at tælle og samtidigt karakterisere strukturerne af dets individuelle medlemmer. (Ii) Komplekse reaktionsveje kan direkte dechifteres i single-molecule FRET-undersøgelser, fordi der ikke er brug for nogen synkronisering af et ensemble. (Iii) FRET kan få adgang til en bred vifte af tidsmæssige domæner, der spænder over 10 årtier og dækker et bredt udvalg af biologisk relevante dynamikker. (Iv) FRET-eksperimenter kan udføres under eventuelle opløsningsbetingelser in vitro såvel som in vivo . Kombinationen af ​​FRET med fluorescensmikroskopi muliggør undersøgelsen af ​​molekylære strukturer og interaktioner direkte i levende celler 15 , 16 , </<html> Sup&gt; 17 , 18 , 19 , selv med høj præcision 20 . (V) FRET kan påføres systemer med næsten enhver størrelse ( fx polyprolin oligomerer 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , HIV revers transkriptase 26 og ribosomer 27 ). (Vi) Endelig kan et netværk af afstande, der indeholder alle dimensioner af biomolekyler, anvendes til at udlede strukturelle modeller af statiske eller dynamiske molekyler 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref &quot;&gt; 35 , 36 , 37 . Derfor kan single-molekyle FRET-spektroskopi anvendes til at udlede afstande, der er nøjagtige nok til at anvendes til distansbegrænset strukturel modellering 26 . Dette er muligt ved at udnytte multiparameterfluorescensdetektion (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , som udnytter otte dimensioner af fluorescensinformation ( dvs. excitationsspektrum, fluorescensspektrum, anisotropi, fluorescenslevetid, fluorescensekvantumudbytte, Makroskopisk tid, fluorescensintensiteterne og afstanden mellem fluoroforer) til præcist og præcist at tilvejebringe afstandsbegrænsninger. Derudover kombineres pulseret interleaved excitation (PIE) med MFD(PIE-MFD) 42 til overvågning af direkte excitationsacceptorfluorescens og for at udvælge enkeltmolekylehændelser, der stammer fra prøver indeholdende en 1: 1 donor-til-acceptorstøkiometri. En typisk PIE-MFD-opsætning bruger topulserede interleaved excitationslasere forbundet til et konfokalt mikroskopkrop, hvor fotonetektion er opdelt i fire forskellige kanaler i forskellige spektrale vinduer og polarisationsegenskaber. Flere detaljer findes i figur 1 . Det er vigtigt at bemærke, at FRET skal kombineres med beregningsmetoder for at opnå atomistiske strukturelle modeller, der er i overensstemmelse med FRET-resultaterne 26 , 30 . Det er ikke målet med den nuværende protokol at gå over den tilknyttede metode til at opbygge strukturelle modeller med FRET-afledte afstande. Disse fremgangsmåder er imidlertid blevet anvendt i kombination med andre teknikker ( fx røntgenspredning med små vinklerIng eller elektron paramagnetisk resonans), der føder området for integrativ strukturel biologi 43 , 44 , 45 , 46 . Det nuværende mål er at bane vejen for FRET som et kvantitativt værktøj inden for strukturbiologi. Som et eksempel blev denne metode anvendt til at identificere tre konformationelle tilstande i det ligandbindende domæne (LBD) af N-methyl-D-aspartat (NMDA) -receptoren. Det endelige mål er at overvinde ovennævnte begrænsninger og at bringe FRET blandt de integrerende metoder, der anvendes til strukturel bestemmelse af biomolekyler ved at tilvejebringe målte afstande med høj præcision.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">charcoal</td>
			<td style="width:183px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:119px;">K42964486 320</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">syringe filter</td>
			<td style="width:183px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">09-719C</td>
			<td>size: 0.20um</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">chambered coverglass</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">155409</td>
			<td>1.5 borosilicate glass, 8 wells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">microscope cover glass</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">063014-9</td>
			<td>size: 24X60-1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">148859</td>
			<td>nuclease free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">tween-20</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28320</td>
			<td>10% solution of Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">acceptor DNA strand (High FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">178124895</td>
			<td>5&#180;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">acceptor DNA strand (Low FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">177956424</td>
			<td>5&#180;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">donor DNA strand</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">177951437</td>
			<td>5&#180; -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">DNA strand (No FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>5&#180; -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">thermal cycler</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">E6331000025</td>
			<td>nexus gradient</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Alexa Fluor 488 C5&#160;Maleimide</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A10254</td>
			<td>termed cyan-green fluorophore in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Alexa Fluor 647 C2&#160;Maleimide</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A20347</td>
			<td>termed far-red fluorophore in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Rhodamine 110</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83695-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Rhodamine 101</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83694-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1426</td>
			<td>For culture of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A0166</td>
			<td>Used at 100 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Tetracyline&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">58346</td>
			<td>Used at 12.5 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP906-5</td>
			<td>Used at 15 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Origami B(DE3) Competent Cells</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">70837-3</td>
			<td>Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1755</td>
			<td>For induction of E. coli protein expression</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">HiTrap Chelating HP</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0409-01</td>
			<td>For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Imidazole</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">56749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Ni-NTA Agarose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PD-10 Desalting Column</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">AktaPurifier</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28406264</td>
			<td>FPLC Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Dialysis tubing</td>
			<td style="width:183px;">Spectrum labs</td>
			<td style="width:119px;">132562</td>
			<td>15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Dichroics</td>
			<td style="width:183px;">Semrock</td>
			<td style="width:119px;">FF500/646-Di01-25x36</td>
			<td>500/646 BrightLight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">50/50 Beam splitter polarizer</td>
			<td style="width:183px;">Qioptiq Linos&#160;</td>
			<td style="width:119px;">G33 5743 000</td>
			<td>10x10 film polarizer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Green pass filer</td>
			<td style="width:183px;">Chroma</td>
			<td style="width:119px;">ET525/50m</td>
			<td style="width:167px;">ET525/50m 25 mm diameter mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Red pass filter</td>
			<td style="width:183px;">Chroma</td>
			<td>ET720/150m</td>
			<td>ET720/150m 25 mm diameter mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Power Meter</td>
			<td style="width:183px;">ThorLabd</td>
			<td style="width:119px;">PM200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:183px;">Varian</td>
			<td style="width:119px;">Cary300Bio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fluorolog 3 fluorometer</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">FL3-22-R3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fluorohub TCSPC controller</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">Fluorohub-B</td>
			<td>TCSPC electronics for ensemble measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">NanoLed 485L</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">485L</td>
			<td>Blue diode laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">NanoLed 635L</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">635L</td>
			<td>Red diode laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Olympus IX73 Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX73P2F</td>
			<td>Microscope frame</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PMA 40 Hybrid Detector</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">932200, PMA 40</td>
			<td>Optimized for green detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PMA 50 Hybrid Detector</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">932201, PMA 50</td>
			<td>Optimized for ed shifter sensitivity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">485nm laser</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">LDH-D-C-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">640nm laser</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">LDH-D-C-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Hydraharp 400 and TTTR acqusition software</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant</td>
			<td align="right" style="width:119px;">930021</td>
			<td>Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">SEPIA II SLM 828 and SEPIA software</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant</td>
			<td align="right" style="width:119px;">910028</td>
			<td>Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">computer</td>
			<td style="width:183px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">optiplex 7010</td>
			<td>cpu: i7-3770 ram:16GB</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">FRET Positioning and Screening (FPS) software</td>
			<td style="width:183px;">Heinrich Heine Unviersity</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">MFD suite</td>
			<td style="width:183px;">Heinrich Heine Unviersity</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high precision fret at single-molecule level for biomolecule structure determination

En protokol om, hvordan man udfører høj præcision interdye distance målinger ved hjælp af Förster resonans energi overførsel (FRET) på single-molekylen niveau i multiparameter fluorescens detektion (MFD) tilstand er vist her. MFD maksimerer brugen af ​​alle &quot;dimensioner&quot; af fluorescens for at reducere fotofysiske og eksperimentelle artefakter og muliggør måling af interdyeafstand med en nøjagtighed på op til ~ 1 Å i stive biomolekyler. Denne metode blev anvendt til at identificere tre konformationelle tilstande af det ligandbindende domæne af N-methyl-D-aspartat (NMDA) -receptoren for at forklare aktiveringen af ​​receptoren efter ligandbinding. Ved sammenligning af de kendte krystallografiske strukturer med eksperimentelle målinger var de enige om mindre end 3 Å for mere dynamiske biomolekyler. At samle et sæt afstandsbegrænsninger, der dækker hele dimensionen af ​​biomolekylerne, ville gøre det muligt at tilvejebringe en strukturel model af dynamisk biomolekyles.

I typiske smFRET-eksperimenter, der anvender en MFD-opsætning (laserlinier: 485 nm ved 60 μW og 640 nm ved 23 μW, sektion 5.1) fortyndes fluorescensprøven til en lavpikomolær koncentration ( 10-12 M = 1 pM) og anbringes I et konfokalmikroskop, hvor en subnanosekund laserpuls exciterer mærkede molekyler, som diffunderer frit gennem et excitationsvolumen. Et typisk konfokalt volumen er &lt;4 femtoliters (fL). Ved sådanne lave koncentrationer detekteres kun enkeltmolekyler...

Watch this Scientific Journal Video about High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination at JoVE.com

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

En protokol til høj præcision FRET eksperimenter på det enkelte molekylniveau er præsenteret her. Derudover kan denne metode anvendes til at identificere tre konformationelle tilstande i det ligandbindende domæne af N-methyl-D-aspartat (NMDA) -receptoren. Fastlæggelse af præcise afstande er det første skridt i retning af opbygning af strukturelle modeller baseret på FRET eksperimenter.

High Precision FRET på enkeltmolekyliveau for biomolekylstrukturbestemmelse

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Strukturel Oplysninger fra Single-molekyle FRET Eksperimenter Brug af Fast Nano-positionering System

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

En enkel, Robust og høj overførselshastighed enkelt molekyle Flow strækker Assay gennemførelse for at studere Transport af molekyler langs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Enkelt-molekyle Manipulation af G-quadruplexes af magnetiske pincet

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Høj overførselshastighed, absolut bestemmelse af indholdet af en markeret Protein i væv niveauer ved hjælp af kvantitative Dot duppes analyse (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Ved hjælp af trefarvet enkelt-molekyle FRET at studere sammenhængen af Protein interaktioner

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente immobilisering af proteiner for enkelt molekyle kraft spektroskopi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantificering af mærkning homogenitet på enkelt-molekyle niveau

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Enkeltcelleanalyse af transskriptionsaktive alleler efter enkeltmolekyle FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Præcis og præcis enkeltmolekyle FRET-målinger ved hjælp af Open Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Enkeltmolekylebilleddannelse af EWS-FLI1-kondensater, der samles på DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...