Name: high precision fret at single-molecule level for biomolecule structure determination
Uploaded: 2017-05-13T14:00:00
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VJ und HS bestätigen Unterstützung von NIH R01 GM094246 bis VJ. HS erkennt Start-up-Fonds aus dem Clemson University Creative Anfrage-Programm und dem Zentrum für Optische Materialien Wissenschaft und Technik Technologien an der Clemson University. Dieses Projekt wurde auch von einem Ausbildungsstipendium des Keck-Zentrums für interdisziplinäre Bioscience Training der Golfküstenkonsortien (NIGMS Grant Nr. 1 T32GM089657-05) und der Schissler Stiftungsstipendium für Translationsstudien allgemeiner menschlicher Krankheiten an DD unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health dar.

1. PBS-Puffer-Vorbereitung und Kammerbehandlung HINWEIS: Bei der Durchführung von nasschemischen Experimenten einen Laborkittel und Einweghandschuhe tragen. Verwenden Sie den Augenschutz beim Ausrichten des Lasers. <ol><li> PBS-Pufferzubereitung <ol><li> Man löst 4,5 g Na 2 HPO 4 , 0,44 g NaH 2 PO 4 und 3,5 g NaCl in 400 ml destilliertem Wasser. Sicherstellen eines pH-Werts von 7,5 und Sterilisieren der Lösung durch Autoklavie...

In dieser Arbeit wird das Protokoll zur Ausrichtung, Kalibrierung und Messung von Interdye-Abständen mit hoher Präzision unter Verwendung von PIE-MFD-Einzelmolekül-FRET-Experimenten vorgestellt. Durch sorgfältige Kalibrierung aller Instrumentalparameter kann man die Genauigkeit der gemessenen Distanzen erhöhen und die Angstrom-Genauigkeit erreichen. Dazu werden verschiedene multidimensionale Histogramme verwendet, um Populationen zur weiteren Charakterisierung zu analysieren und zu identifizieren. Unter Verwendung ...

Ein wesentliches Ziel der strukturellen Biologie ist es, die Beziehung zwischen Struktur und Funktion von biomolekularen Maschinen zu entschlüsseln. Der erste visuelle Eindruck von Biomolekülen ( zB Proteine ​​und Nukleinsäuren) trat in den 1950er Jahren durch die Entwicklung der Röntgenkristallographie 1 , 2 auf . Die Röntgenkristallographie liefert hochauflösende, statische Strukturinformationen, die durch die Kristallpackung eingeschränkt werden. Daher scheut die inhärente Unbeweglichkeit von Röntgenstrukturmodellen die dynamische Natur von Biomolekülen, ein Faktor, der die meisten biologischen Funktionen 3 , 4 , 5 beeinflusst. Kernmagnetische Resonanz (NMR) 6 , 7 , 8 lieferte eine alternative Lösung für das Problem durch die Lösung von Strukturmodellen in wässrigen Lösungen. Ein großer VorteilVon NMR ist seine Fähigkeit, die intrinsische Dynamik von Biomolekülen und Konformationsensembles wiederherzustellen, was hilft, die intrinsischen Beziehungen zwischen Struktur, Dynamik und Funktion 3 , 4 , 5 zu klären. Trotzdem erfordert NMR, begrenzt durch Stichprobengröße und große Probenmengen, komplexe Etikettierungsstrategien für größere Systeme. Daher besteht ein dringender Bedarf, alternative Methoden in der Strukturbiologie zu entwickeln. Historisch gesehen hat die Förster-Resonanz-Energieübertragung (FRET) 9 in der Strukturbiologie keine wichtige Rolle gehabt, weil das FRÜSSE, dass FRET mit einer geringen Genauigkeitsmessung ausgestattet ist. Es ist der Zweck dieses Protokolls, die Fähigkeit von FRET zu überprüfen, um Entfernungen auf der Nanometer-Skala zu bestimmen, so dass diese Abstände für den Aufbau von Strukturmodellen von Biomolekülen verwendet werden können. Die erste experimentelle VerifikationDie Abweichung von der R - 6 - Abhängigkeit von der FRET - Effizienz wurde von Stryer im Jahre 1967 10 durch Messung von Polyprolinen verschiedener Längen als &quot;spektroskopisches Lineal&quot; durchgeführt. Ein ähnliches Experiment wurde auf der Einzelmolekül-Ebene im Jahr 2005 erreicht 11 . Polyprolin-Moleküle erwiesen sich als nicht-ideal, und so wurden doppelsträngige DNA-Moleküle später verwendet 12 . Dies öffnete das Fenster für präzise Abstandsmessungen und die Idee, FRET zu verwenden, um strukturelle Eigenschaften von Biomolekülen zu identifizieren. FRET ist optimal, wenn der Interdye-Distanzbereich von ~ 0.6-1.3 R 0 liegt , wobei R 0 der Förster-Abstand ist. Für typische Fluorophore, die in Einzelmolekül-FRET-Experimenten verwendet werden, beträgt R &amp; sub0 ; ~ 50 Å. Typischerweise bietet FRET viele Vorteile gegenüber anderen Methoden in seiner Fähigkeit, die Strukturen und Dynamiken zu lösen und zu differenzierenHeterogene Systeme: (i) Aufgrund der ultimativen Empfindlichkeit der Fluoreszenz können einzelne Molekül-FRET-Experimente 13 , 14 , 15 , 16 heterogene Ensembles durch direktes Zählen und gleichzeitiges Charakterisieren der Strukturen ihrer einzelnen Mitglieder lösen. (Ii) Komplexe Reaktionswege können in Einzelmolekül-FRET-Studien direkt entschlüsselt werden, da keine Synchronisation eines Ensembles erforderlich ist. (Iii) FRET kann auf eine breite Palette von zeitlichen Domänen zugreifen, die sich über 10 Jahrzehnte erstrecken und eine Vielzahl von biologisch relevanten Dynamiken abdecken. (Iv) FRET-Experimente können in beliebigen Lösungsbedingungen sowohl in vitro als auch in vivo durchgeführt werden. Die Kombination von FRET mit Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die Untersuchung molekularer Strukturen und Wechselwirkungen direkt in lebenden Zellen 15 , 16 , </<html> Sup&gt; 17 , 18 , 19 , auch mit hoher Präzision 20 . (V) FRET kann auf Systeme von nahezu jeder Grße angewendet werden ( z. B. Polyprolin-Oligomere 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , HIV-Reverse-Transkriptase 26 und Ribosomen 27 ). (Vi) Schließlich könnte ein Netzwerk von Abständen, das alle Dimensionalitäten von Biomolekülen enthält, verwendet werden, um strukturelle Modelle von statischen oder dynamischen Molekülen 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref &quot;&gt; 35 , 36 , 37 . Daher kann die Einzelmolekül-FRET-Spektroskopie verwendet werden, um Abstände abzuleiten, die präzise genug sind, um für die Distanz-zurückhaltende Strukturmodellierung verwendet zu werden 26 . Dies ist möglich, indem man die Multiparameter-Fluoreszenzdetektion (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , die acht Dimensionen von Fluoreszenzinformationen verwendet ( dh Anregungsspektrum, Fluoreszenzspektrum, Anisotropie, Fluoreszenzlebensdauer, Fluoreszenzquantenausbeute, Makroskopische Zeit, die Fluoreszenzintensitäten und der Abstand zwischen den Fluorophoren), um genau und präzise Abstandsbeschränkungen zu liefern. Zusätzlich wird die gepulste verschachtelte Erregung (PIE) mit MFD kombiniert(PIE-MFD) 42, um die direkte Anregungsakzeptorfluoreszenz zu überwachen und Einzelmolekülereignisse auszuwählen, die aus Proben resultieren, die eine 1: 1-Donor-zu-Akzeptor-Stöchiometrie enthalten. Ein typischer PIE-MFD-Aufbau verwendet zwei gepulste verschachtelte Anregungslaser, die mit einem konfokalen Mikroskopkörper verbunden sind, wobei die Photonendetektion in vier verschiedene Kanäle in verschiedenen Spektralfenstern und Polarisationseigenschaften aufgeteilt wird. Weitere Details finden Sie in Abbildung 1 . Es ist wichtig zu beachten, dass FRET mit rechnerischen Methoden kombiniert werden muss, um atomistische Strukturmodelle zu erreichen, die mit den FRET-Ergebnissen 26 , 30 übereinstimmen. Es ist nicht das Ziel des vorliegenden Protokolls, über die damit verbundene Methodik zu gehen, um Strukturmodelle mit FRET-abgeleiteten Abständen zu erstellen. Diese Ansätze wurden jedoch in Kombination mit anderen Techniken ( z. B. Kleinwinkel-Röntgenstreuung) angewendetOder Elektronen-paramagnetische Resonanz), die Geburten des Feldes der integrativen Strukturbiologie 43 , 44 , 45 , 46 . Das aktuelle Ziel ist es, den Weg für FRET als quantitatives Werkzeug in der Strukturbiologie zu ebnen. Als Beispiel wurde diese Methode verwendet, um drei Konformationszustände in der Ligandenbindungsdomäne (LBD) des N-Methyl-D-aspartat (NMDA) -Rezeptors zu identifizieren. Ziel ist es, die vorgenannten Einschränkungen zu überwinden und FRET zu den integrativen Methoden zu bringen, die für die strukturelle Bestimmung von Biomolekülen verwendet werden, indem gemessene Distanzen mit hoher Präzision bereitgestellt werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">charcoal</td>
			<td style="width:183px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:119px;">K42964486 320</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">syringe filter</td>
			<td style="width:183px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">09-719C</td>
			<td>size: 0.20um</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">chambered coverglass</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">155409</td>
			<td>1.5 borosilicate glass, 8 wells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">microscope cover glass</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">063014-9</td>
			<td>size: 24X60-1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">148859</td>
			<td>nuclease free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">tween-20</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28320</td>
			<td>10% solution of Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">acceptor DNA strand (High FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">178124895</td>
			<td>5&#180;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">acceptor DNA strand (Low FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">177956424</td>
			<td>5&#180;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">donor DNA strand</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">177951437</td>
			<td>5&#180; -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">DNA strand (No FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>5&#180; -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">thermal cycler</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">E6331000025</td>
			<td>nexus gradient</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Alexa Fluor 488 C5&#160;Maleimide</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A10254</td>
			<td>termed cyan-green fluorophore in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Alexa Fluor 647 C2&#160;Maleimide</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A20347</td>
			<td>termed far-red fluorophore in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Rhodamine 110</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83695-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Rhodamine 101</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83694-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1426</td>
			<td>For culture of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A0166</td>
			<td>Used at 100 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Tetracyline&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">58346</td>
			<td>Used at 12.5 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP906-5</td>
			<td>Used at 15 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Origami B(DE3) Competent Cells</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">70837-3</td>
			<td>Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1755</td>
			<td>For induction of E. coli protein expression</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">HiTrap Chelating HP</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0409-01</td>
			<td>For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Imidazole</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">56749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Ni-NTA Agarose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PD-10 Desalting Column</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">AktaPurifier</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28406264</td>
			<td>FPLC Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Dialysis tubing</td>
			<td style="width:183px;">Spectrum labs</td>
			<td style="width:119px;">132562</td>
			<td>15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Dichroics</td>
			<td style="width:183px;">Semrock</td>
			<td style="width:119px;">FF500/646-Di01-25x36</td>
			<td>500/646 BrightLight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">50/50 Beam splitter polarizer</td>
			<td style="width:183px;">Qioptiq Linos&#160;</td>
			<td style="width:119px;">G33 5743 000</td>
			<td>10x10 film polarizer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Green pass filer</td>
			<td style="width:183px;">Chroma</td>
			<td style="width:119px;">ET525/50m</td>
			<td style="width:167px;">ET525/50m 25 mm diameter mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Red pass filter</td>
			<td style="width:183px;">Chroma</td>
			<td>ET720/150m</td>
			<td>ET720/150m 25 mm diameter mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Power Meter</td>
			<td style="width:183px;">ThorLabd</td>
			<td style="width:119px;">PM200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:183px;">Varian</td>
			<td style="width:119px;">Cary300Bio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fluorolog 3 fluorometer</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">FL3-22-R3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fluorohub TCSPC controller</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">Fluorohub-B</td>
			<td>TCSPC electronics for ensemble measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">NanoLed 485L</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">485L</td>
			<td>Blue diode laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">NanoLed 635L</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">635L</td>
			<td>Red diode laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Olympus IX73 Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX73P2F</td>
			<td>Microscope frame</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PMA 40 Hybrid Detector</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">932200, PMA 40</td>
			<td>Optimized for green detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PMA 50 Hybrid Detector</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">932201, PMA 50</td>
			<td>Optimized for ed shifter sensitivity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">485nm laser</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">LDH-D-C-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">640nm laser</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">LDH-D-C-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Hydraharp 400 and TTTR acqusition software</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant</td>
			<td align="right" style="width:119px;">930021</td>
			<td>Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">SEPIA II SLM 828 and SEPIA software</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant</td>
			<td align="right" style="width:119px;">910028</td>
			<td>Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">computer</td>
			<td style="width:183px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">optiplex 7010</td>
			<td>cpu: i7-3770 ram:16GB</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">FRET Positioning and Screening (FPS) software</td>
			<td style="width:183px;">Heinrich Heine Unviersity</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">MFD suite</td>
			<td style="width:183px;">Heinrich Heine Unviersity</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high precision fret at single-molecule level for biomolecule structure determination

Ein Protokoll zur Durchführung von hochpräzisen Interdye-Distanzmessungen mit Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET) auf der Einzelmolekül-Ebene im Multiplex-Fluoreszenz-Nachweis (MFD) -Modus wird hier vorgestellt. MFD maximiert die Nutzung aller &quot;Dimensionen&quot; der Fluoreszenz, um photophysikalische und experimentelle Artefakte zu reduzieren und ermöglicht die Messung der Interdye-Distanz mit einer Genauigkeit bis zu ~ 1 Å in starren Biomolekülen. Diese Methode wurde verwendet, um drei Konformationszustände der Ligandenbindungsdomäne des N-Methyl-D-aspartat (NMDA) -Rezeptors zu identifizieren, um die Aktivierung des Rezeptors bei der Ligandenbindung zu erklären. Beim Vergleich der bekannten kristallographischen Strukturen mit experimentellen Messungen stimmten sie innerhalb von weniger als 3 Å für mehr dynamische Biomoleküle zu. Das Sammeln eines Satzes von Abstandsbeschränkungen, die die gesamte Dimensionalität der Biomoleküle abdecken, würde es ermöglichen, ein Strukturmodell eines dynamischen Biomoleküls bereitzustellenEs

In typischen smFRET-Experimenten unter Verwendung eines MFD-Aufbaus (Laserlinien: 485 nm bei 60 μW und 640 nm bei 23 μW, Abschnitt 5.1) wird die Fluoreszenzprobe auf eine niedrigpikomolare Konzentration (10 -12 M = 1 pM) verdünnt und platziert In einem konfokalen Mikroskop, bei dem ein Sub-Nanosekunden-Laserpuls markierte Moleküle erregt, die durch ein Erregungsvolumen frei diffundieren. Ein typisches konfokales Volumen ist &lt;4 femtoliter (fL). Bei derart niedrigen Konze...

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High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Ein Protokoll für hochpräzise FRET-Experimente auf der Ebene der einzelnen Moleküle wird hier vorgestellt. Zusätzlich kann diese Methodik verwendet werden, um drei Konformationszustände in der Ligandenbindungsdomäne des N-Methyl-D-aspartat (NMDA) -Rezeptors zu identifizieren. Die Bestimmung von präzisen Abständen ist der erste Schritt zum Aufbau von Strukturmodellen auf der Basis von FRET-Experimenten.

Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Strukturelle Informationen vom Einzelmolekül-FRET-Experimente unter Verwendung des Fast Nano-Positionierungssystem

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

Forschung

Biochemie

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Einfach, Robust und hohen Durchsatz Molekül fließen Stretching Assay-Implementierung für das Studium Transport von Molekülen entlang DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexe von magnetischen Pinzette

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Hoher Durchsatz, Absolute Bestimmung des Inhalts eines ausgewählten Proteins auf Gewebe Ebenen mit quantitativen Dot Blot Analyse (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Verwendung von dreifarbigen Einzelmolekül-Bund, die Korrelation von Protein-Interaktionen zu studieren

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Präzise und genaue Einzelmolekül-FRET-Messungen mit der Open-Source-smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Einzelmolekül-Bildgebung von EWS-FLI1-Kondensaten auf DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...