Name: high precision fret at single-molecule level for biomolecule structure determination
Uploaded: 2017-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination at JoVE.com

VJ ו- HS מאשרים תמיכה מ- NIH R01 GM094246 ל- VJ. HS מכיר בכספי סטארט-אפ מתכנית המחקר של אוניברסיטת קלמסון, והמרכז לחומרים אופטיים במדע וטכנולוגיות הנדסיות באוניברסיטת קלמסון. פרויקט זה נתמך גם על ידי הכשרה הכשרה של מרכז קק עבור בינתחומי ביו-הכשרה של קונסורציוני חוף המפרץ (מענק NIGMS מס &#39;1 T32GM089657-05) ואת קרן מלגות Schissler עבור מחקרים תירגוליים של מחלות נפש נפוצות ל DD. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

1. הכנת PBS הכנת טיפול הקאמרית הערה: ללבוש מעיל מעבדה כפפות חד פעמיות בעת ביצוע ניסויים כימיים רטובים. השתמש בהגנה על העין בעת ​​יישור הלייזר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת PBS חיץ <ol style=";text-align:right;dire...

בעבודה זו, פרוטוקול ליישר, לכייל, ולמדוד interdye מרחקים עם דיוק גבוהה באמצעות PIE-MFD יחיד מולקולה ניסויים סריג מוצג. על ידי כיול קפדני של כל הפרמטרים האינסטרומנטליים, ניתן להגדיל את הדיוק של המרחקים הנמדדים ולהגיע לדיוק אנגסטרום. לשם כך, היסטוגרמות רב-ממדיות שונות משמשות ל...

המטרה הבסיסית של מחקרים ביולוגיים מבניים היא לפענח את הקשר בין המבנה לתפקוד של מכונות biomolecular. הרושם החזותי הראשון של ביומולקולות ( למשל, חלבונים וחומצות גרעין) התרחש בשנות החמישים באמצעות קריסטלוגרפיה רנטגן של פיתוח רנטגן 1 , 2 . קריסטלוגרפיה רנטגן מספק ברזולוציה גבוהה, מידע מבניים סטטי מוגבל על ידי האריזה גביש. לכן, חוסר הקיום הטמון של מודלים מבניים רנטגן shuns את הטבע הדינמי של biomolecules, גורם המשפיע על פונקציות ביולוגיות ביותר 3 , 4 , 5 . תהודה מגנטית גרעינית (תמ&quot;ג) 6 , 7 , 8 סיפק פתרון חלופי לבעיה על ידי פתרון מודלים מבניים בתמיסות מימיות. יתרון גדולשל תמ&quot;ג היא היכולת שלו לשחזר את הטבע הדינמי הפנימי של biomolecules והרכבים קונפורמציה, אשר מסייע להבהיר את היחסים המהותיים בין המבנה, הדינמיקה, ואת הפונקציה 3 , 4 , 5 . עם זאת, תמ&quot;ג, המוגבל על ידי גודל המדגם וכמויות גדולות של מדגם, דורש אסטרטגיות תיוג מורכבות עבור מערכות גדולות יותר. לכן, יש צורך דחוף לפתח שיטות חלופיות בביולוגיה מבנית. מבחינה היסטורית, Förster תהודה העברת אנרגיה (סריג) 9 לא לקח תפקיד חשוב בביולוגיה מבנית בגלל misconception כי סריג מספק דיוק נמוך מדידות המרחק. זוהי המטרה של פרוטוקול זה כדי לבקר את היכולת של סריג כדי לקבוע מרחקים בסולם ננומטר, כך מרחקים אלה יכולים לשמש לבניית מודלים מבניים של biomolecules. הראשון ניסיוני verificAtion של תלות R - 6 על יעילות סריג נעשה על ידי Stryer ב -1967 10 על ידי מדידת polyprolines באורך שונים כמו &quot;השליט ספקטרוסקופית&quot;. ניסוי דומה הושג ברמת מולקולה אחת בשנת 2005 11 . מולקולות פוליפרו-ליין התגלו כאי-אידיאליות, ולכן, מולקולות דנ&quot;א בעלות גדילה כפולה שימשו מאוחר יותר 12 . זה פתח את החלון למדידות המרחק המדויק ואת הרעיון של שימוש FRET לזהות מאפיינים מבניים של ביומולקולות. FRET הוא אופטימלי כאשר טווח המרחק interdye הוא מ ~ 0.6-1.3 R 0 , כאשר R 0 הוא המרחק Förster. עבור fluorophores טיפוסית המשמשים יחיד מולקולה ניסויים סריג, R 0 הוא ~ 50 Å. בדרך כלל, FRET מציע יתרונות רבים על פני שיטות אחרות ביכולתה לפתור ולהבדיל את המבנים ואת הדינמיקה במערכות הטרוגניות: (i) בשל הרגישות האולטימטיבית של הקרינה, יחיד מולקולה ניסויים סריג 13 , 14 , 15 , 16 יכול לפתור הרכבים הטרוגניים על ידי ספירה ישירה ובו זמנית אפיון המבנים של חבריו הפרט. (Ii) מסלולי תגובה מורכבים ניתן לפענח ישירות במחקרים מולקולה בודדת, משום שאין צורך בסנכרון של אנסמבל. (Iii) סריג יכול לגשת למגוון רחב של תחומים הזמניים כי טווח מעל 10 שנים בזמן, כיסוי מגוון רחב של דינמיקה רלוונטית ביולוגית. (IV) ניסויים סריג ניתן לבצע בכל תנאי פתרון, במבחנה, כמו גם in vivo . השילוב של סריג עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשר לימוד של מבנים מולקולרית אינטראקציות ישירות תאים חיים 15 , 16 , </<html> Sup&gt; 17 , 18 , 19 , אפילו עם דיוק גבוה 20 . (V) סריג ניתן ליישם מערכות כמעט בכל גודל ( למשל, olipomers polyproline 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , HIV transcriptase 26 , ו ribosomes 27 ). (Vi) לבסוף, רשת של מרחקים המכיל את כל ממדי biomolecules יכול לשמש כדי להפיק מודלים מבניים של מולקולות סטטי או דינמי 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref &quot;&gt; 35 , 36 , 37 . לכן, ספקטרוסקופית יחיד מולקולה סריג ניתן להשתמש כדי להפיק מרחקים כי הם מדויקים מספיק כדי לשמש מודלים מבודדים מבודדים מרחוק 26 . זה אפשרי על ידי ניצול של multiparameter פלואורסצנטי איתור (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , אשר מנצל שמונה מימדים של מידע הקרינה ( כלומר, ספקטרום עירור, ספקטרום הקרינה, אניזוטרופיה, חיים הקרינה, התשואה הקוונטית פלואורסצנטי, זמן macroscopic, את עוצמות הקרינה, ואת המרחק בין fluorophores) כדי במדויק ומדויק לספק מגבלות מרחק. בנוסף, פעימה interleaved עירור (PIE) משולב עם MFD(PIE-MFD) 42 לפקח ישיר עירור ישיר פלואורסצנטי ולבחור אירועים מולקולה אחת הנובעת דגימות המכיל 1: 1 התורם ל-סטואיצ&#39;יומטרי. התקנה טיפוסית PIE-MFD משתמשת בשני פעמי לייזרים מעורבים interleaved המחוברים לגוף מיקרוסקופ confocal, שבו זיהוי פוטון מחולק לארבעה ערוצים שונים בחלונות ספקטראליים שונים תכונות קיטוב. פרטים נוספים ניתן למצוא באיור 1 . חשוב לציין כי סריג חייב להיות משולב עם שיטות חישוביות להשיג מודלים דמויי מבנה אטומיסטי כי הם בקנה אחד עם תוצאות סריג 26 , 30 . זה לא המטרה של הפרוטוקול הנוכחי ללכת על המתודולוגיה המשויך לבנות מודלים מבניים עם מרחקים נגזר סריג. עם זאת, גישות אלה יושמו בשילוב עם טכניקות אחרות ( למשל, זווית קטנה פיזור רנטגןIng או תהודה פרמגנטית אלקטרונים), הלידה לתחום הביולוגיה המבנית האינטגרטיבית 43 , 44 , 45 , 46 . המטרה הנוכחית היא לסלול את הדרך עבור סריג ככלי כמותי בביולוגיה מבנית. לדוגמה, מתודולוגיה זו שימשה לזיהוי שלושה מצבי קונפורמציה בתחום LigD של LDD של קולטן N-Methyl-D-aspartate (NMDA). המטרה הסופית היא להתגבר על המגבלות הנ&quot;ל ולהביא FRET בין השיטות האינטגרטיביות המשמשים לקביעת המבנים של ביומולקולות על ידי מתן מרחקים נמדדים בדייקנות גבוהה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">charcoal</td>
			<td style="width:183px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:119px;">K42964486 320</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">syringe filter</td>
			<td style="width:183px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">09-719C</td>
			<td>size: 0.20um</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">chambered coverglass</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">155409</td>
			<td>1.5 borosilicate glass, 8 wells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">microscope cover glass</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">063014-9</td>
			<td>size: 24X60-1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">148859</td>
			<td>nuclease free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">tween-20</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28320</td>
			<td>10% solution of Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">acceptor DNA strand (High FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">178124895</td>
			<td>5&#180;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">acceptor DNA strand (Low FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">177956424</td>
			<td>5&#180;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">donor DNA strand</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">177951437</td>
			<td>5&#180; -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">DNA strand (No FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>5&#180; -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">thermal cycler</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">E6331000025</td>
			<td>nexus gradient</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Alexa Fluor 488 C5&#160;Maleimide</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A10254</td>
			<td>termed cyan-green fluorophore in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Alexa Fluor 647 C2&#160;Maleimide</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A20347</td>
			<td>termed far-red fluorophore in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Rhodamine 110</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83695-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Rhodamine 101</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83694-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1426</td>
			<td>For culture of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A0166</td>
			<td>Used at 100 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Tetracyline&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">58346</td>
			<td>Used at 12.5 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP906-5</td>
			<td>Used at 15 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Origami B(DE3) Competent Cells</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">70837-3</td>
			<td>Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1755</td>
			<td>For induction of E. coli protein expression</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">HiTrap Chelating HP</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0409-01</td>
			<td>For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Imidazole</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">56749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Ni-NTA Agarose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PD-10 Desalting Column</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">AktaPurifier</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28406264</td>
			<td>FPLC Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Dialysis tubing</td>
			<td style="width:183px;">Spectrum labs</td>
			<td style="width:119px;">132562</td>
			<td>15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Dichroics</td>
			<td style="width:183px;">Semrock</td>
			<td style="width:119px;">FF500/646-Di01-25x36</td>
			<td>500/646 BrightLight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">50/50 Beam splitter polarizer</td>
			<td style="width:183px;">Qioptiq Linos&#160;</td>
			<td style="width:119px;">G33 5743 000</td>
			<td>10x10 film polarizer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Green pass filer</td>
			<td style="width:183px;">Chroma</td>
			<td style="width:119px;">ET525/50m</td>
			<td style="width:167px;">ET525/50m 25 mm diameter mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Red pass filter</td>
			<td style="width:183px;">Chroma</td>
			<td>ET720/150m</td>
			<td>ET720/150m 25 mm diameter mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Power Meter</td>
			<td style="width:183px;">ThorLabd</td>
			<td style="width:119px;">PM200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:183px;">Varian</td>
			<td style="width:119px;">Cary300Bio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fluorolog 3 fluorometer</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">FL3-22-R3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fluorohub TCSPC controller</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">Fluorohub-B</td>
			<td>TCSPC electronics for ensemble measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">NanoLed 485L</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">485L</td>
			<td>Blue diode laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">NanoLed 635L</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">635L</td>
			<td>Red diode laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Olympus IX73 Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX73P2F</td>
			<td>Microscope frame</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PMA 40 Hybrid Detector</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">932200, PMA 40</td>
			<td>Optimized for green detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PMA 50 Hybrid Detector</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">932201, PMA 50</td>
			<td>Optimized for ed shifter sensitivity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">485nm laser</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">LDH-D-C-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">640nm laser</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">LDH-D-C-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Hydraharp 400 and TTTR acqusition software</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant</td>
			<td align="right" style="width:119px;">930021</td>
			<td>Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">SEPIA II SLM 828 and SEPIA software</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant</td>
			<td align="right" style="width:119px;">910028</td>
			<td>Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">computer</td>
			<td style="width:183px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">optiplex 7010</td>
			<td>cpu: i7-3770 ram:16GB</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">FRET Positioning and Screening (FPS) software</td>
			<td style="width:183px;">Heinrich Heine Unviersity</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">MFD suite</td>
			<td style="width:183px;">Heinrich Heine Unviersity</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high precision fret at single-molecule level for biomolecule structure determination

פרוטוקול על איך לבצע דיוק גבוהה מדידות מרחק interdye באמצעות העברת אנרגיה תהודה Förster (סריג) ברמת מולקולה אחת במצב multifarameter פלואורסצנטי (MFD) מוצג כאן. MFD ממקסם את השימוש של כל &quot;ממדים&quot; של הקרינה כדי להפחית חפצים מלאכותיים photophysical ומאפשר למדידת המרחק interdye עם דיוק עד ~ 1 ב ביומולקולות נוקשה. שיטה זו שימשה לזיהוי שלושה מצבי קונפורמציה של תחום ליגנד מחייב של קולטן N-methyl-D-aspartate (NMDA) כדי להסביר את הפעלת הקולטן על ליגנד מחייב. כאשר משווים את מבנים קריסטלוגרפיים ידוע עם מדידות ניסיוני, הם הסכימו בתוך פחות מ 3 עבור ביומולקולות דינמי יותר. איסוף קבוצה של מעצורים המרחק המכסה את כל ממדי של biomolecules יאפשר לספק מודל מבני של biomolecul דינמיEs.

בניסויים SMFRET טיפוסי באמצעות הגדרת MFD (קווי לייזר: 485 ננומטר ב 60 μW ו 640 ננומטר ב 23 μW, סעיף 5.1), מדגם הקרינה הוא מדולל לריכוז נמוך picomolar (10 -12 M = 1 pM) והניח ב מיקרוסקופ confocal, שבו דופק לייזר sub-nanosecond מרגש שכותרתו מולקולות חופשי מתפזר דרך נפח עירור. נפח confocal...

Watch this Scientific Journal Video about High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination at JoVE.com

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

פרוטוקול דיוק גבוהה ניסויים FRET ברמת מולקולה אחת מוצגת כאן. בנוסף, מתודולוגיה זו יכולה לשמש כדי לזהות שלושה מצבי קונפורמציה בתחום ליגנד מחייב של קולטן N-methyl-D-aspartate (NMDA). קביעת מרחקים מדויקים היא הצעד הראשון לקראת בניית מודלים מבניים המבוססים על ניסויים סריג.

דיוק גבוהה סריג ברמת מולקולה בודדת עבור קביעת מבנה ביומולקולה

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

מידע מבני מ-מולקולה בודדת סריג ניסויים באמצעות מערכת ננו-המיצוב המהירה

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

מולקולה בודדת פשוטה, חסון וגבוה התפוקה זרימה מתיחה Assay יישום לימוד התחבורה של מולקולות לאורך הדנ א

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

מולקולה בודדת מניפולציה של G-quadruplexes על ידי פינצטה מגנטי

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

תפוקה גבוהה, נחישות מוחלטת של התוכן של חלבון שנבחר ברמות רקמות באמצעות נקודה כמותיים כתם ניתוח (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

באמצעות תלת-צבעי קשת/קשתית מולקולה בודדת ללמוד הקורלציה של אינטראקציות חלבון

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

ביצוע מדידות FRET מדויקות ומדויקות באמצעות smfBox קוד פתוח

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

הדמיה של מולקולה בודדת של עיבוי EWS-FLI1 המורכב על DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...