Name: high precision fret at single-molecule level for biomolecule structure determination
Uploaded: 2017-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination at JoVE.com

वीजे और एचएस एनआईएच आर 01 जीएम094246 से वीजे के लिए समर्थन का समर्थन करते हैं। एचएस क्लेमसन यूनिवर्सिटी क्रिएटिव इनक्वायरी प्रोग्राम और कलेमोसन यूनिवर्सिटी में ऑप्टिकल मटेरियल साइंस एंड इंजीनियरिंग टेक्नोलॉजीज के केंद्र से शुरूआती निधि को स्वीकार करता है। इस परियोजना को खाड़ी तट consortia (एनआईजीएमएस ग्रांट नंबर 1 टी 32 जीएम 0889657-05) के इंटरडिसीप्लिनरी बायोसाइंस ट्रेनिंग के लिए केक सेंटर से प्रशिक्षण फेलोशिप और डीडी के लिए आम मानव रोगों के अनुवाद अध्ययन के लिए स्किसलर फाउंडेशन फैलोशिप भी समर्थित था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करती है।

1. पीबीएस बफर तैयारी और चैंबर उपचार नोट: गीला रासायनिक प्रयोगों का प्रदर्शन करते समय एक प्रयोगशाला कोट और डिस्पोजेबल दस्ताने पहनें। लेजर को संरेखित करते समय आंख की सुरक्षा का उपयोग करें। <ol><...

इस काम में प्रोटोकॉल पीआईई-एमएफडी एकल-अणू FRET प्रयोगों का उपयोग करते हुए उच्च परिशुद्धता के साथ अंतराल दूरी को संरेखित करने, जांचना और मापना है। ध्यान से सभी सहायक मापदंडों को मापने के द्वारा, एक मापा दू?...

संरचनात्मक जीव विज्ञान के अध्ययन का एक मूल लक्ष्य, बायोमोलेक्युलर मशीनों की संरचना और कार्य के बीच संबंध को सुलझाना है। बायोमोलेक्लस ( जैसे, प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड) का पहला दृश्य प्रभाव 1 9 50 के दशक में एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी 1 , 2 के विकास में हुआ । एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफ़ी क्रिस्टल पैकिंग द्वारा विवश किए गए उच्च-रिज़ॉल्यूशन, स्थिर संरचनात्मक जानकारी प्रदान करती है। इसलिए, एक्स-रे संरचनात्मक मॉडल की अंतर्निहित गतिशीलता जैव-ऊर्जा के गतिशील प्रकृति को दूर करती है, एक ऐसा कारक जो अधिकांश जैविक कार्यों को प्रभावित करता है 3 , 4 , 5 । परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) 6 , 7 , 8 ने जलीय समाधानों में संरचनात्मक मॉडल को हल करके समस्या का एक वैकल्पिक समाधान प्रदान किया है। एक महान लाभएनएमआर का जैव-घनत्व और गठनात्मक ensembles के आंतरिक गतिशील प्रकृति को पुनर्प्राप्त करने की इसकी क्षमता है, जो संरचना, गतिशीलता और 3 , 4 , 5 समारोह के बीच आंतरिक रिश्तों को स्पष्ट करने में मदद करता है। फिर भी, एनएमआर, नमूना आकार और बड़ी मात्रा में नमूना द्वारा सीमित है, बड़े प्रणालियों के लिए जटिल लेबलिंग रणनीति की आवश्यकता होती है। इसलिए, संरचनात्मक जीव विज्ञान में वैकल्पिक तरीकों को विकसित करने की आवश्यकता है। ऐतिहासिक रूप से, फोर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरईटी) 9 ने गलत धारणा के कारण संरचनात्मक जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण भूमिका नहीं ली है कि FRET कम सटीकता दूरी माप प्रदान करता है। नैनोमीटर पैमाने पर दूरी तय करने के लिए FRET की क्षमता को फिर से प्राप्त करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य है, जैसे कि ये दूरी बायोमोलेक्लस के संरचनात्मक मॉडल के निर्माण के लिए इस्तेमाल की जा सकती हैं। पहला प्रायोगिक verific1 9 67 10 में आरएफटीटी दक्षता पर आर -6 की निर्भरता को स्ट्रैयर ने विभिन्न लंबाई के पॉलीप्रोलिन को मापकर &quot;स्पेक्ट्रोस्कोपिक शासक&quot; के रूप में किया था। 2005 11 में एकल-अणु स्तर पर एक समान प्रयोग पूरा किया गया था। पॉलीप्रोलिन अणु गैर-आदर्श बन गए, और इस तरह, डबल-फंसे डीएनए अणुओं को बाद में 12 का इस्तेमाल किया गया। यह सटीक दूरी मापन के लिए खिड़की खोलता है और बायोमोलेक्लस के संरचनात्मक गुणों की पहचान करने के लिए FRET का उपयोग करने का विचार है। FRET इष्टतम है जब अंतरार्इ दूरी सीमा ~ 0.6-1.3 आर 0 से है , जहां आर 0 फ़र्स्टर दूरी है। एकल अणु FRET प्रयोगों में प्रयुक्त विशिष्ट फ्लोरोफोर्स के लिए, आर 0 ~ 50 Å है। आमतौर पर, एफईआरटी अन्य तरीकों से अधिक लाभ प्रदान करता है जिसमें संरचनाओं और गतिशीलता को हल करने और अंतर करने की अपनी क्षमता होती है।विषम प्रणालियों: (i) प्रतिदीप्ति की अंतिम संवेदनशीलता के कारण, एकल अणु FRET प्रयोगों 13 , 14 , 15 , 16 विषुव गलतियों को सीधे गिनती और एक साथ अपने व्यक्तिगत सदस्यों की संरचनाओं को चिह्नित करके हल कर सकती है। (Ii) कॉम्प्लेक्स रिएक्शन पाथवे को अकेले अणु FRET अध्ययनों में सीधे समझा जा सकता है क्योंकि किसी कलाकार की टुकड़ी की जरूरत नहीं है। (Iii) एफईआरटी समय-समय पर 10 दशकों से अधिक समय तक अस्थायी डोमेनों तक पहुंच सकता है, जिसमें विभिन्न प्रकार की जैविक रूप से प्रासंगिक गतिशीलता शामिल है। (Iv) एफआरईटी प्रयोग किसी भी समाधान की स्थिति में किया जा सकता है, इन विट्रो और विवो में । प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ FRET का संयोजन सीधे जीवित कोशिकाओं 15 , 16 में आणविक संरचनाओं और अंतःक्रियाओं के अध्ययन के लिए अनुमति देता है , </<html> Sup&gt; 17 , 18 , 19 , यहां तक ​​कि उच्च परिशुद्धता 20 के साथ (V) FRET लगभग किसी भी आकार ( जैसे, पॉलीप्रोलिन ऑलिगॉमर 21 , 22 , 23 , 24 , एचएसपीडीएडी 25 , एचआईवी रिवर्स ट्रांस्क्रिप्टेज़ 26 , और राइबोसोम 27 ) के सिस्टम पर लागू किया जा सकता है। (Vi) अंत में, बायोमोलेक्लस के सभी आयाम में शामिल दूरीों का एक नेटवर्क स्थिर या गतिशील अणुओं 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 के संरचनात्मक मॉडल प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।रेफरी &quot;&gt; 35 , 36 , 37 इसलिए, एकल-अणू FRET स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग दूरस्थ दूरी को रोकने के लिए किया जा सकता है, जो दूरी-प्रतिरोधित संरचनात्मक मॉडलिंग 26 के लिए पर्याप्त सटीक हैं। प्रतिदीप्ति जानकारी ( यानी, उत्तेजना स्पेक्ट्रम, प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम, अनिसोट्रॉपी, प्रतिदीप्ति जीवनकाल, प्रतिदीप्ति क्वांटम उपज, आईसीआईडीएक्स, फ्लोरोसेंट्स) के आठ आयामों का उपयोग करते हुए, multiparameter fluorescence detection (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 का लाभ उठाकर संभव है। मैक्रोस्कोपिक समय, प्रतिदीप्ति तीव्रताएं, और फ्लोरोफोर्स के बीच की दूरी) को ठीक से और ठीक से दूरी की रोकथाम प्रदान करते हैं। इसके अतिरिक्त, स्पंदित इंटरलीव्ड उत्तेजना (पीआईई) को एमएफडी के साथ जोड़ा जाता है(पीआईई-एमएफडी) 42 सीधे उत्तेजना स्वीकारकर्ता प्रतिदीप्ति पर नजर रखने के लिए और एकल 1: 1 दाता-से-स्वीकार्य स्टेइचीयमेट्री वाले नमूनों से उत्पन्न एकल-अणु घटनाओं का चयन करने के लिए। एक ठेठ पीआईई-एमएफडी सेटअप दो स्पंदित इंटरलीव्ड उत्तेजना लेज़रों का उपयोग एक confocal खुर्दबीन शरीर से जुड़ा है, जहां फोटोन का पता लगाने के विभिन्न वर्णक्रमीय खिड़कियों और ध्रुवीकरण विशेषताओं में चार अलग-अलग चैनलों में विभाजित है। अधिक जानकारी चित्रा 1 में पाई जा सकती है। यह ध्यान रखना जरूरी है कि एफआरईटी को परमाणु जैसी संरचनात्मक मॉडल हासिल करने के लिए कम्प्यूटेशनल विधियों के साथ जोड़ा जाना चाहिए जो कि FRET परिणाम 26 , 30 के अनुरूप हैं। FRET- व्युत्पन्न दूरी के साथ संरचनात्मक मॉडल बनाने के लिए संबंधित पद्धति पर जाने के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल का लक्ष्य नहीं है। हालांकि, इन तरीकों को अन्य तकनीकों के साथ संयोजन में लागू किया गया है ( उदाहरण के लिए, छोटे-कोण एक्स-रे स्कैटरआईएनजी या इलेक्ट्रॉन परमैग्नेटिक अनुनाद), एकीकृत संरचनात्मक जीव विज्ञान के क्षेत्र में जन्म देने के लिए 43 , 44 , 45 , 46 । वर्तमान लक्ष्य संरचनात्मक जीव विज्ञान में एक मात्रात्मक उपकरण के रूप में FRET के लिए मार्ग प्रशस्त करना है। एक उदाहरण के रूप में, इस पद्धति का उपयोग एन-मिथाइल-डी-एस्पेटेट (एनएमडीए) रिसेप्टर के लेगंड-बाइंडिंग डोमेन (एलबीडी) में तीन गठनात्मक राज्यों की पहचान करने के लिए किया गया था। अंतिम लक्ष्य उच्च परिशुद्धता के साथ मापा दूरी प्रदान करके बायोमोलेक्लस के संरचनात्मक दृढ़ संकल्प के लिए इस्तेमाल की जाने वाली समेकित विधियों के बीच पूर्वनिर्धारित सीमाओं को दूर करना है और FRET को लाने के लिए है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">charcoal</td>
			<td style="width:183px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:119px;">K42964486 320</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">syringe filter</td>
			<td style="width:183px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">09-719C</td>
			<td>size: 0.20um</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">chambered coverglass</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">155409</td>
			<td>1.5 borosilicate glass, 8 wells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">microscope cover glass</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">063014-9</td>
			<td>size: 24X60-1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">148859</td>
			<td>nuclease free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">tween-20</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28320</td>
			<td>10% solution of Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">acceptor DNA strand (High FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">178124895</td>
			<td>5&#180;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">acceptor DNA strand (Low FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">177956424</td>
			<td>5&#180;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">donor DNA strand</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">177951437</td>
			<td>5&#180; -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">DNA strand (No FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>5&#180; -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">thermal cycler</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">E6331000025</td>
			<td>nexus gradient</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Alexa Fluor 488 C5&#160;Maleimide</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A10254</td>
			<td>termed cyan-green fluorophore in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Alexa Fluor 647 C2&#160;Maleimide</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A20347</td>
			<td>termed far-red fluorophore in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Rhodamine 110</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83695-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Rhodamine 101</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83694-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1426</td>
			<td>For culture of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A0166</td>
			<td>Used at 100 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Tetracyline&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">58346</td>
			<td>Used at 12.5 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP906-5</td>
			<td>Used at 15 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Origami B(DE3) Competent Cells</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">70837-3</td>
			<td>Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1755</td>
			<td>For induction of E. coli protein expression</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">HiTrap Chelating HP</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0409-01</td>
			<td>For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Imidazole</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">56749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Ni-NTA Agarose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PD-10 Desalting Column</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">AktaPurifier</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28406264</td>
			<td>FPLC Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Dialysis tubing</td>
			<td style="width:183px;">Spectrum labs</td>
			<td style="width:119px;">132562</td>
			<td>15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Dichroics</td>
			<td style="width:183px;">Semrock</td>
			<td style="width:119px;">FF500/646-Di01-25x36</td>
			<td>500/646 BrightLight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">50/50 Beam splitter polarizer</td>
			<td style="width:183px;">Qioptiq Linos&#160;</td>
			<td style="width:119px;">G33 5743 000</td>
			<td>10x10 film polarizer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Green pass filer</td>
			<td style="width:183px;">Chroma</td>
			<td style="width:119px;">ET525/50m</td>
			<td style="width:167px;">ET525/50m 25 mm diameter mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Red pass filter</td>
			<td style="width:183px;">Chroma</td>
			<td>ET720/150m</td>
			<td>ET720/150m 25 mm diameter mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Power Meter</td>
			<td style="width:183px;">ThorLabd</td>
			<td style="width:119px;">PM200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:183px;">Varian</td>
			<td style="width:119px;">Cary300Bio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fluorolog 3 fluorometer</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">FL3-22-R3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fluorohub TCSPC controller</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">Fluorohub-B</td>
			<td>TCSPC electronics for ensemble measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">NanoLed 485L</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">485L</td>
			<td>Blue diode laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">NanoLed 635L</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">635L</td>
			<td>Red diode laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Olympus IX73 Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX73P2F</td>
			<td>Microscope frame</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PMA 40 Hybrid Detector</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">932200, PMA 40</td>
			<td>Optimized for green detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PMA 50 Hybrid Detector</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">932201, PMA 50</td>
			<td>Optimized for ed shifter sensitivity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">485nm laser</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">LDH-D-C-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">640nm laser</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">LDH-D-C-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Hydraharp 400 and TTTR acqusition software</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant</td>
			<td align="right" style="width:119px;">930021</td>
			<td>Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">SEPIA II SLM 828 and SEPIA software</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant</td>
			<td align="right" style="width:119px;">910028</td>
			<td>Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">computer</td>
			<td style="width:183px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">optiplex 7010</td>
			<td>cpu: i7-3770 ram:16GB</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">FRET Positioning and Screening (FPS) software</td>
			<td style="width:183px;">Heinrich Heine Unviersity</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">MFD suite</td>
			<td style="width:183px;">Heinrich Heine Unviersity</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high precision fret at single-molecule level for biomolecule structure determination

मल्टीपरैमेटर फ्लोरोसेंस डिटेक्शन (एमएफडी) मोड में एक-अणु स्तर पर फ़ॉर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरईटी) का उपयोग करते हुए उच्च-सटीक अंतराल दूरी माप के लिए एक प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया गया है। एमएफडी photophysical और प्रायोगिक कलाकृतियों को कम करने के लिए प्रतिदीप्ति के सभी &quot;आयामों&quot; के उपयोग को अधिकतम करता है और कठोर बायोमोलेक्लस में ~ 1 ए तक सटीकता के साथ अंतराल दूरी के माप की अनुमति देता है। इस विधि का इस्तेमाल लिगैंड बाइंडिंग पर रिसेप्टर की सक्रियता को समझने के लिए एन-मिथाइल-डी-एस्पेपेटेट (एनएमडीए) रिसेप्टर के लेगंड बाइंडिंग डोमेन के तीन गठबंधन वाले राज्यों की पहचान करने के लिए किया गया था। प्रायोगिक माप के साथ ज्ञात क्रिस्टलोग्राफिक संरचनाओं की तुलना करते समय, वे और अधिक गतिशील जीवोलेक्लस के लिए 3 से कम आधे के भीतर सहमत हुए। बायोमोलेक्लस की संपूर्ण आयाम को कवर करने वाली दूरी संयम के एक सेट को इकट्ठा करने से गतिशील जैव-आणविक का एक संरचनात्मक मॉडल प्रदान करना संभव होगातों।

एक एमएफडी सेटअप (लेजर लाइनों: 48 μW पर 60 μW और 640 एनएम पर 23 μW, अनुभाग 5.1) का उपयोग करते हुए ठेठ smFRET प्रयोगों में, प्रतिदीप्ति नमूना निम्न-पिकोकोलोलर एकाग्रता (10 -12 एम = 1 पीएम) के लिए पतला होता है और रखा ...

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High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

एकल अणु स्तर पर उच्च-सटीक FRET प्रयोगों के लिए एक प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया गया है। इसके अतिरिक्त, इस पद्धति का उपयोग एन-मिथाइल-डी-एस्पेटेट (एनएमडीए) रिसेप्टर के लिगंड-बाइंडिंग डोमेन में तीन गठनात्मक स्थितियों को पहचानने के लिए किया जा सकता है। सटीक दूरी निर्धारित करना FRET प्रयोगों के आधार पर संरचनात्मक मॉडल बनाने की दिशा में पहला कदम है।

बायोमोलेस्क्यू संरचना निर्धारण के लिए एकल अणु स्तर पर उच्च शुद्धता FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

एकल अणु से जानकारी संरचनात्मक झल्लाहट तेजी से नैनो पोजिशनिंग सिस्टम का उपयोग कर प्रयोगों

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

एक सरल, मजबूत, और उच्च प्रवाह एकल अणु डीएनए के साथ अणुओं के परिवहन के अध्ययन के लिए परख कार्यांवयन खींच प्रवाह

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

जी के एकल अणु हेरफेर-चुंबकीय चिमटी द्वारा quadruplexes

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

उच्च प्रवाह, मात्रात्मक डॉट दाग विश्लेषण का उपयोग ऊतक के स्तर पर एक चयनित प्रोटीन की सामग्री का निरपेक्ष निर्धारण (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

तीन रंग एकल अणु झल्लाहट का उपयोग प्रोटीन बातचीत के सहसंबंध का अध्ययन करने के लिए

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए प्रोटीन की आबंध स्थिरीकरण

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

प्रोसिटोम एकल अणु स्तर पर लेबलिंग एकरूपता का व्यापक परिमाणन

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

एकल अणु मछली द्वारा ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिव एलील्स का एकल सेल विश्लेषण

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

ओपन-सोर्स smfBox का उपयोग कर सटीक और सटीक एकल-अणु FRET माप बनाना

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

डीएनए पर एकत्र होने वाले ईडब्ल्यूएस-एफएलआई 1 कंडेनसेट की एकल-अणु इमेजिंग

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...