Name: high precision fret at single-molecule level for biomolecule structure determination
Uploaded: 2017-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination at JoVE.com

VJ og HS anerkjenner støtte fra NIH R01 GM094246 til VJ. HS anerkjenner oppstartsmidler fra Clemson University Creative Inquiry Program og Center for Optical Materials Science and Engineering Technologies ved Clemson University. Dette prosjektet ble også støttet av et opplæringsfellesskap fra Keck Center for Tverrfaglig Bioscience Training av Gulf Coast Consortia (NIGMS Grant No. 1 T32GM089657-05) og Schissler Foundation Fellowship for Translational Studies of Common Human Diseases til DD. Innholdet er bare forfatterens ansvar og representerer ikke nødvendigvis den offisielle oppfatningen av National Institutes of Health.

1. PBS buffer forberedelse og kammerbehandling MERK: Bruk et laboratoriejakke og engangshansker når du utfører våte kjemiske eksperimenter. Bruk øyevern når du justerer laseren. <ol><li> PBS buffer forberedelse <ol><li> Oppløs 4,5 g Na2HP04, 0,44 g NaH2P04 og 3,5 g NaCl i 400 ml destillert vann. Sørg for en pH på 7,5 og steriliser oppløsningen ved autoklavering i en væskesyklus i 1 time (avhengig av autoklavsystemet). </li><li> Ta 15 ml av PBS-løsningen og bland...

I dette arbeidet presenteres protokollen for å justere, kalibrere og måle interdye avstander med høy presisjon ved bruk av PIE-MFD single-molecule FRET eksperimenter. Ved nøye å kalibrere alle instrumentelle parametere kan man øke nøyaktigheten av de målte avstandene og nå angstrom-nøyaktigheten. For å gjøre det, brukes ulike flerdimensjonale histogrammer til å analysere og identifisere populasjoner for videre karakterisering. Ved å bruke gjennomsnittlig makro tid for å verifisere stabiliteten til de mål...

Et grunnleggende mål for strukturelle biologistudier er å løse sammenhengen mellom strukturen og funksjonen til biomolekylære maskiner. Det første visuelle inntrykk av biomolekyler ( f.eks . Proteiner og nukleinsyrer) skjedde på 1950-tallet gjennom utviklingsrøntgenkrystallografi 1 , 2 . Røntgenkrystallografi gir høyoppløselig, statisk strukturell informasjon begrenset av krystallpakningen. Derfor skjuler den iboende immobiliteten til røntgenkonstruksjonsmodeller dynamisk natur av biomolekyler, en faktor som påvirker de fleste biologiske funksjoner 3 , 4 , 5 . Kjernemagnetisk resonans (NMR) 6 , 7 , 8 ga en alternativ løsning på problemet ved å løse strukturelle modeller i vandige løsninger. En stor fordelAv NMR er dets evne til å gjenopprette den indre dynamiske naturen til biomolekyler og konformasjons-ensembler, noe som bidrar til å avklare de inneboende forhold mellom struktur, dynamikk og funksjon 3 , 4 , 5 . Likevel krever NMR, begrenset av prøvestørrelse og store mengder prøve, komplekse merkestrategier for større systemer. Derfor er det et presserende behov for å utvikle alternative metoder i strukturell biologi. Historisk har Forster resonans energioverføring (FRET) 9 ikke tatt en viktig rolle i strukturell biologi på grunn av misforståelsen at FRET gir avstandsmålinger med lav nøyaktighet. Formålet med denne protokollen er å revidere FRETs evne til å bestemme avstandene på nanometerskalaen, slik at disse avstandene kan brukes til å bygge strukturelle modeller av biomolekyler. Den første eksperimentelle verifikasjonenAtion av R - 6- avhengigheten av FRET-effektiviteten ble utført av Stryer i 1967 10 ved måling av polyproliner av forskjellige lengder som en &quot;spektroskopisk linjal&quot;. Et lignende eksperiment ble oppnådd på enkeltmolekylivå i 2005 11 . Polyprolinmolekyler viste seg å være ikke-ideelle, og dermed ble dobbeltstrengede DNA-molekyler senere brukt 12 . Dette åpnet vinduet for presise avstandsmålinger og ideen om å bruke FRET for å identifisere strukturelle egenskaper av biomolekyler. FRET er optimal når intervallavstanden er fra ~ 0,6-1,3 R 0 , hvor R 0 er Forster-avstanden. For typiske fluorforer som brukes i single-molekyl-FRET-eksperimenter, er R0 ~ 50 Å. FRET tilbyr vanligvis mange fordeler over andre metoder i sin evne til å løse og skille mellom strukturer og dynamikk iHeterogene systemer: (i) På grunn av den ultimative følsomheten av fluorescens kan enkeltmolekylære FRET-eksperimenter 13 , 14 , 15 , 16 løse heterogene ensembler ved direkte å telle og samtidig karakterisere strukturen av dets individuelle medlemmer. (Ii) Komplekse reaksjonsbaner kan direkte dechifteres i single-molecule FRET-studier fordi ingen synkronisering av et ensemble er nødvendig. (Iii) FRET kan få tilgang til et bredt spekter av tidsmessige domener som spenner over ti tiår, og dekker et bredt spekter av biologisk relevant dynamikk. (Iv) FRET-eksperimenter kan utføres i eventuelle oppløsningsbetingelser, in vitro såvel som in vivo . Kombinasjonen av FRET med fluorescensmikroskopi tillater studier av molekylære strukturer og interaksjoner direkte i levende celler 15 , 16 , </<html> Sup&gt; 17 , 18 , 19 , selv med høy presisjon 20 . (V) FRET kan påføres systemer med nesten hvilken som helst størrelse ( f.eks. Polyprolinoligomerer 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , HIV revers transkriptase 26 og ribosomer 27 ). (Vi) Endelig kan et nettverk av avstander som inneholder all dimensionalitet av biomolekyler brukes til å utlede strukturelle modeller av statiske eller dynamiske molekyler 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref &quot;&gt; 35 , 36 , 37 . Derfor kan single-molecule FRET-spektroskopi brukes til å utlede avstander som er nøyaktige nok til å brukes til avstandsbestemt strukturell modellering 26 . Dette er mulig ved å benytte seg av multarameterfluorescensdeteksjon (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , som benytter åtte dimensjoner av fluorescensinformasjon ( dvs. eksitasjonsspekter, fluorescensspektrum, anisotropi, fluorescenslevetid, fluorescenskvantumutbytte, Makroskopisk tid, fluorescensintensitetene og avstanden mellom fluoroforer) for nøyaktig og nøyaktig å gi avstandsbegrensninger. I tillegg er pulserende interleaved excitation (PIE) kombinert med MFD(PIE-MFD) 42 for å overvåke direkte eksitasjonsacceptorfluorescens og å velge enkeltmolekylhendelser som oppstår fra prøver som inneholder en 1: 1 donor til akseptorstøkiometri. Et typisk PIE-MFD-oppsett bruker topulserte interleaved exciteringslasere som er koblet til en konfokal mikroskopkropp, hvor fotondeteksjon er delt inn i fire forskjellige kanaler i forskjellige spektralvinduer og polarisasjonsegenskaper. Flere detaljer finner du i Figur 1 . Det er viktig å merke seg at FRET må kombineres med beregningsmetoder for å oppnå atomistiske strukturelle modeller som stemmer overens med FRET-resultatene 26 , 30 . Det er ikke målet med den nåværende protokollen å gå over den tilhørende metodikken for å bygge strukturelle modeller med FRET-avledede avstander. Imidlertid har disse tilnærmingene blitt anvendt i kombinasjon med andre teknikker ( f.eks. VinkelrønttspredningIng eller elektron paramagnetisk resonans), fødte feltet integrativ strukturell biologi 43 , 44 , 45 , 46 . Nåværende mål er å bane vei for FRET som et kvantitativt verktøy i strukturell biologi. Som et eksempel ble denne metoden brukt til å identifisere tre konformasjonelle tilstander i ligandbindende domene (LBD) av N-metyl-D-aspartat (NMDA) reseptoren. Det endelige målet er å overvinne de nevnte begrensningene og å bringe FRET blant de integrerende metodene som brukes til strukturell bestemmelse av biomolekyler ved å gi målte avstander med høy presisjon.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">charcoal</td>
			<td style="width:183px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:119px;">K42964486 320</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">syringe filter</td>
			<td style="width:183px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">09-719C</td>
			<td>size: 0.20um</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">chambered coverglass</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">155409</td>
			<td>1.5 borosilicate glass, 8 wells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">microscope cover glass</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">063014-9</td>
			<td>size: 24X60-1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">148859</td>
			<td>nuclease free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">tween-20</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28320</td>
			<td>10% solution of Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">acceptor DNA strand (High FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">178124895</td>
			<td>5&#180;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">acceptor DNA strand (Low FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">177956424</td>
			<td>5&#180;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">donor DNA strand</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">177951437</td>
			<td>5&#180; -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">DNA strand (No FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>5&#180; -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">thermal cycler</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">E6331000025</td>
			<td>nexus gradient</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Alexa Fluor 488 C5&#160;Maleimide</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A10254</td>
			<td>termed cyan-green fluorophore in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Alexa Fluor 647 C2&#160;Maleimide</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A20347</td>
			<td>termed far-red fluorophore in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Rhodamine 110</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83695-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Rhodamine 101</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83694-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1426</td>
			<td>For culture of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A0166</td>
			<td>Used at 100 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Tetracyline&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">58346</td>
			<td>Used at 12.5 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP906-5</td>
			<td>Used at 15 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Origami B(DE3) Competent Cells</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">70837-3</td>
			<td>Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1755</td>
			<td>For induction of E. coli protein expression</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">HiTrap Chelating HP</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0409-01</td>
			<td>For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Imidazole</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">56749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Ni-NTA Agarose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PD-10 Desalting Column</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">AktaPurifier</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28406264</td>
			<td>FPLC Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Dialysis tubing</td>
			<td style="width:183px;">Spectrum labs</td>
			<td style="width:119px;">132562</td>
			<td>15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Dichroics</td>
			<td style="width:183px;">Semrock</td>
			<td style="width:119px;">FF500/646-Di01-25x36</td>
			<td>500/646 BrightLight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">50/50 Beam splitter polarizer</td>
			<td style="width:183px;">Qioptiq Linos&#160;</td>
			<td style="width:119px;">G33 5743 000</td>
			<td>10x10 film polarizer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Green pass filer</td>
			<td style="width:183px;">Chroma</td>
			<td style="width:119px;">ET525/50m</td>
			<td style="width:167px;">ET525/50m 25 mm diameter mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Red pass filter</td>
			<td style="width:183px;">Chroma</td>
			<td>ET720/150m</td>
			<td>ET720/150m 25 mm diameter mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Power Meter</td>
			<td style="width:183px;">ThorLabd</td>
			<td style="width:119px;">PM200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:183px;">Varian</td>
			<td style="width:119px;">Cary300Bio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fluorolog 3 fluorometer</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">FL3-22-R3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fluorohub TCSPC controller</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">Fluorohub-B</td>
			<td>TCSPC electronics for ensemble measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">NanoLed 485L</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">485L</td>
			<td>Blue diode laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">NanoLed 635L</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">635L</td>
			<td>Red diode laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Olympus IX73 Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX73P2F</td>
			<td>Microscope frame</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PMA 40 Hybrid Detector</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">932200, PMA 40</td>
			<td>Optimized for green detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PMA 50 Hybrid Detector</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">932201, PMA 50</td>
			<td>Optimized for ed shifter sensitivity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">485nm laser</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">LDH-D-C-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">640nm laser</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">LDH-D-C-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Hydraharp 400 and TTTR acqusition software</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant</td>
			<td align="right" style="width:119px;">930021</td>
			<td>Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">SEPIA II SLM 828 and SEPIA software</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant</td>
			<td align="right" style="width:119px;">910028</td>
			<td>Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">computer</td>
			<td style="width:183px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">optiplex 7010</td>
			<td>cpu: i7-3770 ram:16GB</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">FRET Positioning and Screening (FPS) software</td>
			<td style="width:183px;">Heinrich Heine Unviersity</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">MFD suite</td>
			<td style="width:183px;">Heinrich Heine Unviersity</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high precision fret at single-molecule level for biomolecule structure determination

En protokoll om hvordan man utfører høydefinisjonsintervallavstandsmålinger ved hjelp av Förster resonans energioverføring (FRET) på enkeltmolekylnivå i flertarameterfluorescensdeteksjon (MFD) -modus, presenteres her. MFD maksimerer bruken av alle &quot;dimensjoner&quot; av fluorescens for å redusere fotofysiske og eksperimentelle artefakter og muliggjør måling av interdye-avstand med en nøyaktighet på opptil ~ 1 Å i stive biomolekyler. Denne metoden ble brukt til å identifisere tre konformasjonelle tilstander i det ligandbindende domene av N-metyl-D-aspartat (NMDA) reseptoren for å forklare aktiveringen av reseptoren ved ligandbinding. Ved sammenligning av de kjente krystallografiske strukturer med eksperimentelle målinger, var de enige om mindre enn 3 Å for mer dynamiske biomolekyler. Å samle et sett av avstandsbegrensninger som dekker hele dimensionaliteten av biomolekylene, ville gjøre det mulig å gi en strukturell modell av dynamisk biomolekyles.

I typiske smFRET-eksperimenter som bruker en MFD-oppsett (laserlinjene: 485 nm ved 60 μW og 640 nm ved 23 μW, avsnitt 5.1), blir fluorescensprøven fortynnet til en lavpikomolær konsentrasjon ( 10-12 M = 1 pM) og plassert I et konfokalt mikroskop, hvor en subnanosekund laserpuls excites merkede molekyler som diffunderer fritt gjennom et eksitasjonsvolum. Et typisk konfokalt volum er &lt;4 femtoliters (fL). Ved så lave konsentrasjoner blir bare enkeltmolekyler detektert en ...

Watch this Scientific Journal Video about High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination at JoVE.com

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

En protokol for høy presisjon FRET-eksperimenter på enkeltmolekylnivå presenteres her. I tillegg kan denne metoden brukes til å identifisere tre konformasjonelle tilstande i det ligandbindende domenet til N-metyl-D-aspartat (NMDA) reseptoren. Fastsettelse av nøyaktige avstander er det første skrittet mot bygging av strukturelle modeller basert på FRET-eksperimenter.

Høy presisjon FRET ved enkeltmolekylivå for biomolekylstrukturbestemmelse

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Strukturell Informasjon fra Single-molekyl FRET Eksperimenter Bruke Fast Nano-posisjonering System

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

En enkel, Robust og høy gjennomstrømning ett molekyl flyte strekker analysen implementering for å studere Transport av molekyler langs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Single-molekylet manipulering av G-quadruplexes av magnetiske pinsett

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Høy gjennomstrømning, absolutt vilje av innholdet i et valgt Protein på vev nivåer ved hjelp av kvantitative Dot Blot analyse (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Bruker tre farger Single-molekylet bånd å studere sammenhengen av Protein interaksjoner

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente immobilisering av proteiner for ett molekyl Force spektroskopi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom hele kvantifisering av merking homogenitet på ett molekyl nivå

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Enkeltcelleanalyse av transkripsjonsaktive alleler av enkeltmolekyl fisk

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Foreta presise og nøyaktige FRET-målinger med ett molekyl ved hjelp av åpen kildekode-smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Enkeltmolekylavbildning av EWS-FLI1-kondensater som monteres på DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...