Name: high precision fret at single-molecule level for biomolecule structure determination
Uploaded: 2017-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination at JoVE.com

VJ och HS erkänner stöd från NIH R01 GM094246 till VJ. HS erkänner startfonder från Clemson University Creative Research Program och Center for Optical Materials Science and Engineering Technologies vid Clemson University. Detta projekt stöddes också av ett stipendium från Keck Center for Tvärvetenskaplig Bioscience Training of the Gulf Coast Consortia (NIGMS Grant No. 1 T32GM089657-05) och Schissler Foundation Fellowship för Translational Studies of Common Human Diseases till DD. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella synpunkterna från National Institutes of Health.

1. PBS-buffertberedning och kammarbehandling ANMÄRKNING: Använd en laboratorierock och engångshandskar när du utför våtkemiska experiment. Använd ögonskydd när laserlinjen anpassas. <ol><li> PBS-buffertberedning <ol><li> Lös 4,5 g Na2HP04, 0,44 g NaH2P04 och 3,5 g NaCl i 400 ml destillerat vatten. Se till att pH pH 7,5 och sterilisera lösningen genom autoklavering i en vätskecykel i 1 h (beroende på autoklavsystemet). </li><li> Ta 15 ml av PBS-lösningen och b...

I detta arbete presenteras protokollet för att anpassa, kalibrera och mäta intervallavstånd med hög precision med hjälp av PIE-MFD-enkomolekyl-FRET-experiment. Genom noggrant kalibrering av alla instrumentella parametrar kan man öka noggrannheten av de uppmätta avstånden och nå oströmsnoggrannheten. För att göra det används olika multidimensionella histogram för att analysera och identifiera populationer för ytterligare karakterisering. Med hjälp av den genomsnittliga makrotiden för att verifiera stabil...

Ett grundläggande mål för strukturella biologiska studier är att avlägsna förhållandet mellan biomolekylära systemers struktur och funktion. Det första visuella intrycket av biomolekyler ( t.ex. proteiner och nukleinsyror) inträffade under 1950-talet genom utveckling av röntgenkristallografi 1 , 2 . Röntgenkristallografi ger högupplösande, statisk strukturinformation som begränsas av kristallförpackningen. Därför illamående av röntgenstrukturen modellerar den dynamiska naturen hos biomolekylerna, en faktor som påverkar de flesta biologiska funktionerna 3 , 4 , 5 . Kärnmagnetisk resonans (NMR) 6 , 7 , 8 gav en alternativ lösning på problemet genom att lösa strukturella modeller i vattenhaltiga lösningar. En stor fördelAv NMR är dess förmåga att återvinna biomolekylernas inneboende dynamiska natur och konformationella ensembler, vilket bidrar till att klargöra de inneboende relationerna mellan struktur, dynamik och funktion 3 , 4 , 5 . Ändå kräver NMR, begränsad av provstorlek och stora mängder av prov, komplexa märkningsstrategier för större system. Därför finns det ett pressande behov av att utveckla alternativa metoder inom strukturell biologi. Historiskt har Förster resonans energiöverföring (FRET) 9 inte spelat en viktig roll i strukturell biologi på grund av missuppfattningen att FRET ger avståndsmätningar med låg noggrannhet. Syftet med detta protokoll är att se över FRETs förmåga att bestämma avstånd på nanometerskalan, så att dessa avstånd kan användas för att bygga strukturella modeller av biomolekyler. Den första experimentella verifieringenPåverkan av R - 6 beroendet på FRET-effektiviteten gjordes av Stryer 1967 10 genom mätning av polyproliner av olika längder som en &quot;spektroskopisk linjal&quot;. Ett liknande experiment utfördes på en-molekylenivå 2005 2005. Polyprolinmolekyler visade sig vara icke-idealiska, och sålunda användes dubbelsträngade DNA-molekyler senare 12 . Detta öppnade fönstret för exakta avståndsmätningar och idén att använda FRET för att identifiera strukturella egenskaper hos biomolekylerna. FRET är optimal när intervallavståndet är från ~ 0,6-1,3 R 0 , där R 0 är Förster-avståndet. För typiska fluoroforer som används i enkomolekyl-FRET-experiment är R0 ~ 50 Å. FRET erbjuder typiskt många fördelar gentemot andra metoder i sin förmåga att lösa och differentiera strukturerna och dynamiken iHeterogena system: (i) På grund av fluorescens ultimata känslighet kan FRET-experiment med en-molekylen 13 , 14 , 15 , 16 lösa heterogena ensembler genom att direkt räkna och samtidigt karakterisera strukturerna hos dess individuella medlemmar. (Ii) Komplexa reaktionsvägar kan direkt dechifieras i single-molekyl-FRET-studier eftersom ingen synkronisering av ett ensemble behövs. (Iii) FRET kan komma åt ett brett spektrum av temporära domäner som sträcker sig över tio decennier i tid och täcker en mängd olika biologiskt relevanta dynamik. (Iv) FRET-experiment kan utföras under några lösningsbetingelser, in vitro såväl som in vivo . Kombinationen av FRET med fluorescensmikroskopi möjliggör studier av molekylära strukturer och interaktioner direkt i levande celler 15 , 16 , </<html> Sup&gt; 17 , 18 , 19 , även med hög precision 20 . (V) FRET kan appliceras på system med nästan vilken storlek som helst ( t.ex. polyprolinoligomerer 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , HIV-omvänd transkriptas 26 och ribosomer 27 ). (Vi) Slutligen kan ett nätverk av avstånd som innehåller alla dimensionerna av biomolekylerna användas för att härleda strukturella modeller av statiska eller dynamiska molekyler 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref &quot;&gt; 35 , 36 , 37 . Därför kan en-molekyl-FRET-spektroskopi användas för att härleda avstånd som är tillräckligt noga för att användas för distanshållen strukturell modellering 26 . Detta är möjligt genom att utnyttja multiparameterfluorescensdetektering (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , vilken utnyttjar åtta dimensioner av fluorescensinformation ( dvs excitationsspektrum, fluorescensspektrum, anisotropi, fluorescenslivstid, fluorescenskvantumutbyte, Makroskopisk tid, fluorescensintensiteterna och avståndet mellan fluoroforer) för att exakt och exakt tillhandahålla avståndsbestämmelser. Dessutom kombineras pulserad interleaved excitation (PIE) med MFD(PIE-MFD) 42 för att övervaka direkt exciteringsacceptorfluorescens och för att välja enskilda molekylhändelser som härrör från prover innehållande en 1: 1 donor-till-acceptorstökiometri. En typisk PIE-MFD-inställning använder tvåpulserade interleaved excitationslasrar kopplade till en konfokalmikroskopkropp, där fotondetektering delas upp i fyra olika kanaler i olika spektralfönster och polarisationsegenskaper. Mer detaljer finns i Figur 1 . Det är viktigt att notera att FRET måste kombineras med beräkningsmetoder för att uppnå atomistiska strukturella modeller som överensstämmer med FRET-resultat 26 , 30 . Det är inte målet med det nuvarande protokollet att gå över den associerade metoden för att bygga strukturella modeller med FRET-avledda avstånd. Dessa tillvägagångssätt har dock tillämpats i kombination med andra tekniker ( t ex röntgenspridning med lilla vinklarIng eller elektron paramagnetisk resonans), som ger upphov till fältet för integrerande strukturbiologi 43 , 44 , 45 , 46 . Det nuvarande målet är att bana väg för FRET som ett kvantitativt verktyg inom strukturell biologi. Som ett exempel användes denna metod för att identifiera tre konformationella tillstånd i den ligandbindande domänen (LBD) hos N-metyl-D-aspartat (NMDA) -receptorn. Det ultimata målet är att övervinna ovan nämnda begränsningar och att föra FRET bland de integrerade metoderna som används för strukturell bestämning av biomolekyler genom att ge uppmätta avstånd med hög precision.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">charcoal</td>
			<td style="width:183px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:119px;">K42964486 320</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">syringe filter</td>
			<td style="width:183px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">09-719C</td>
			<td>size: 0.20um</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">chambered coverglass</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">155409</td>
			<td>1.5 borosilicate glass, 8 wells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">microscope cover glass</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">063014-9</td>
			<td>size: 24X60-1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">148859</td>
			<td>nuclease free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">tween-20</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28320</td>
			<td>10% solution of Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">acceptor DNA strand (High FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">178124895</td>
			<td>5&#180;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">acceptor DNA strand (Low FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">177956424</td>
			<td>5&#180;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">donor DNA strand</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">177951437</td>
			<td>5&#180; -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">DNA strand (No FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>5&#180; -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">thermal cycler</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">E6331000025</td>
			<td>nexus gradient</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Alexa Fluor 488 C5&#160;Maleimide</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A10254</td>
			<td>termed cyan-green fluorophore in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Alexa Fluor 647 C2&#160;Maleimide</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A20347</td>
			<td>termed far-red fluorophore in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Rhodamine 110</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83695-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Rhodamine 101</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83694-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1426</td>
			<td>For culture of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A0166</td>
			<td>Used at 100 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Tetracyline&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">58346</td>
			<td>Used at 12.5 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP906-5</td>
			<td>Used at 15 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Origami B(DE3) Competent Cells</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">70837-3</td>
			<td>Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1755</td>
			<td>For induction of E. coli protein expression</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">HiTrap Chelating HP</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0409-01</td>
			<td>For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Imidazole</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">56749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Ni-NTA Agarose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PD-10 Desalting Column</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">AktaPurifier</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28406264</td>
			<td>FPLC Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Dialysis tubing</td>
			<td style="width:183px;">Spectrum labs</td>
			<td style="width:119px;">132562</td>
			<td>15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Dichroics</td>
			<td style="width:183px;">Semrock</td>
			<td style="width:119px;">FF500/646-Di01-25x36</td>
			<td>500/646 BrightLight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">50/50 Beam splitter polarizer</td>
			<td style="width:183px;">Qioptiq Linos&#160;</td>
			<td style="width:119px;">G33 5743 000</td>
			<td>10x10 film polarizer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Green pass filer</td>
			<td style="width:183px;">Chroma</td>
			<td style="width:119px;">ET525/50m</td>
			<td style="width:167px;">ET525/50m 25 mm diameter mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Red pass filter</td>
			<td style="width:183px;">Chroma</td>
			<td>ET720/150m</td>
			<td>ET720/150m 25 mm diameter mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Power Meter</td>
			<td style="width:183px;">ThorLabd</td>
			<td style="width:119px;">PM200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:183px;">Varian</td>
			<td style="width:119px;">Cary300Bio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fluorolog 3 fluorometer</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">FL3-22-R3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fluorohub TCSPC controller</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">Fluorohub-B</td>
			<td>TCSPC electronics for ensemble measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">NanoLed 485L</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">485L</td>
			<td>Blue diode laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">NanoLed 635L</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">635L</td>
			<td>Red diode laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Olympus IX73 Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX73P2F</td>
			<td>Microscope frame</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PMA 40 Hybrid Detector</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">932200, PMA 40</td>
			<td>Optimized for green detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PMA 50 Hybrid Detector</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">932201, PMA 50</td>
			<td>Optimized for ed shifter sensitivity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">485nm laser</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">LDH-D-C-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">640nm laser</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">LDH-D-C-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Hydraharp 400 and TTTR acqusition software</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant</td>
			<td align="right" style="width:119px;">930021</td>
			<td>Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">SEPIA II SLM 828 and SEPIA software</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant</td>
			<td align="right" style="width:119px;">910028</td>
			<td>Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">computer</td>
			<td style="width:183px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">optiplex 7010</td>
			<td>cpu: i7-3770 ram:16GB</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">FRET Positioning and Screening (FPS) software</td>
			<td style="width:183px;">Heinrich Heine Unviersity</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">MFD suite</td>
			<td style="width:183px;">Heinrich Heine Unviersity</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high precision fret at single-molecule level for biomolecule structure determination

Ett protokoll om hur man utför precisionsintervallavståndsmätningar med hjälp av Förster resonansenergiöverföring (FRET) på molekylenivå i multiparameterfluorescensdetektering (MFD) -läget presenteras här. MFD maximerar användningen av alla &quot;dimensioner&quot; av fluorescens för att minska fotofysiska och experimentella artefakter och möjliggör mätning av intervallavstånd med en noggrannhet upp till ~ 1 Å i styva biomolekyler. Denna metod användes för att identifiera tre konformationella tillstånd hos den ligandbindande domänen hos N-metyl-D-aspartat (NMDA) -receptorn för att förklara aktiveringen av receptorn efter ligandbindning. När man jämför de kända kristallografiska strukturerna med experimentella mätningar, kom de överens om mindre än 3 Å för mer dynamiska biomolekyler. Att samla en uppsättning avståndsbestämmelser som täcker hela dimensionen av biomolekylerna skulle göra det möjligt att tillhandahålla en strukturell modell av dynamisk biomolekyles.

I typiska smFRET-experiment som använder en MFD-inställning (laserlängder: 485 nm vid 60 μW och 640 nm vid 23 μW, avsnitt 5.1) spädas fluorescensprovet till en lågpikomolär koncentration (10-12 M = 1 pM) och placeras I ett konfokalt mikroskop, där en subnanosekund laserpuls exciterar märkta molekyler som diffunderar fritt genom en excitationsvolym. En typisk konfokalvolym är &lt;4 femtoliters (fL). Vid sådana låga koncentrationer detekteras endast enstaka molekyler en i tage...

Watch this Scientific Journal Video about High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination at JoVE.com

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Ett protokoll för hög precision FRET-experiment på den enda molekylnivån presenteras här. Dessutom kan denna metod användas för att identifiera tre konformationella tillstånd i den ligandbindande domänen av N-metyl-D-aspartat (NMDA) -receptorn. Att bestämma exakta avstånd är det första steget mot att bygga strukturella modeller baserade på FRET-experiment.

Hög precision FRET vid en-molekylnivå för biomolekylstrukturbestämning

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Strukturell information från enda molekyl FRET Experiment Använda Fast Nano-positioneringssystem

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

En enkel, Robust och hög genomströmning enda molekyl Flow Stretching Assay genomförandet för att studera Transport av molekyler längs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Singel-molekyl Manipulation av G-quadruplexes av magnetisk pincett

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Hög genomströmning, absolut bestämning av halten av ett Protein som är valda på vävnad nivåer med hjälp av kvantitativa Dot Blot analys (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Använda tre färger singel-molekyl bandet att studera korrelationen av proteininteraktioner

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalent immobilisering av proteiner för den enda molekyl kraft spektroskopin

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantifiering av märkning homogenitet på nivån enda molekyl

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Encellsanalys av transkriptionellt aktiva alleler med enmolekylig FISK

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Göra exakta och exakta enmolekyliga FRET-mätningar med hjälp av SmfBox med öppen källkod

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Enmolekylär avbildning av EWS-FLI1-kondensat som monteras på DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...