Name: high precision fret at single-molecule level for biomolecule structure determination
Uploaded: 2017-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination at JoVE.com

VJ ve HS, NIH R01 GM094246&#39;dan VJ&#39;ye verilen desteği onaylar. HS, Clemson Üniversitesi Yaratıcı Sorgulama Programı ve Clemson Üniversitesi&#39;ndeki Optik Malzeme Bilimi ve Mühendisliği Teknolojileri Merkezi&#39;nden yeni teşebbüs kredilerini onayladı. Bu proje aynı zamanda Körfez Sahil Konsorsiyumu için Keck Merkezi&#39;nden (NIGMS Grant No.1 T32GM089657-05) Interdisciplinary Bioscience Training için bir eğitim fakültesi ve DD için Ortak İnsan Hastalıklarının Translasyonel Çalışmaları için Schissler Vakfı Topluluğu tarafından da desteklendi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri&#39;nin resmi görüşlerini temsil etmez.

1. PBS Tampon Hazırlama ve Oda Tedavisi NOT: Islak kimyasal deneyler yaparken bir laboratuar ceketi ve tek kullanımlık eldiven giyin. Lazeri hizalarken göz koruma kullanın. <ol><li> PBS tampon preparasyonu <ol><li> 400 mL distile edilmiş suda 4.5 g Na2HPO4, 0.44 g NaH2PO4 ve 3.5 g NaCI çözündürün. 7.5 pH değerine getirin ve solüsyonu 1 saat süreyle otoklavlayarak sterilize edin (otoklav sistemine bağlı olarak). </li><li> 15 mL PBS solüsyonunu alın ve 0,1 ...

Bu çalışmada, PIE-MFD tek moleküllü FRET deneyleri kullanılarak, boyalar arası mesafeleri yüksek hassasiyetle hizalamak, kalibre etmek ve ölçmek için protokol sunulmuştur. Tüm enstrüman parametrelerini titizlikle kalibre ederek, ölçülen uzaklıkların doğruluğunu artırabilir ve Angstrom doğruluğuna erişebilirsiniz. Bunu yapmak için, daha fazla karakterizasyon için popülasyonları analiz etmek ve tanımlamak için çeşitli çok boyutlu histogramlar kullanılır. Ölçülen numunelerin kararlıl...

Yapısal biyoloji çalışmalarının temel amacı, biyomoleküler makinelerin yapısı ve işlevi arasındaki ilişkiyi ortaya çıkarmaktır. Biyomoleküllerin ( örn., Proteinler ve nükleik asitler) ilk görsel izlenimi 1950&#39;lerde X-ışını kristalografisi 1 , 2 ile oluştu. X-ışını kristalografisi, kristal ambalaj ile sınırlandırılmış yüksek çözünürlüklü, statik yapısal bilgiler sağlar. Bu nedenle, X-ışını yapısal modellerinin doğasında olan hareketsizliği, biyomoleküllerin dinamik doğasından kaçınır; bu, çoğu biyolojik fonksiyonları etkileyen bir faktördür 3 , 4 , 5 . Nükleer manyetik rezonans (NMR) 6 , 7 , 8 sulu solüsyonlarda yapısal modelleri çözerek problemin alternatif bir çözümünü sağlamıştır. Büyük bir avantajNMR, yapısı, dinamikleri ve fonksiyonu arasındaki gerçek ilişkileri netleştirmeye yardımcı olan biyomoleküllerin ve konformasyonel toplulukların intrensek dinamik doğasını kurtarma yeteneğidir. 3 , 4 , 5 . Bununla birlikte, NMR, numune büyüklüğü ve büyük miktarlarda numune ile sınırlı olduğundan, daha büyük sistemler için karmaşık etiketleme stratejileri gerektirir. Bu nedenle, yapısal biyolojide alternatif yöntemler geliştirmek için acilen bir ihtiyaç vardır. Tarihsel olarak, Förster rezonans enerji transferi (FRET) 9 , yapısal biyolojide önemli bir rol oynamadı FRET&#39;in düşük doğruluklu mesafe ölçümleri sağladığı yanılgısından dolayı. Bu protokolün amacı, FRET&#39;in nanometre ölçeğindeki mesafeleri belirleme yeteneğini tekrar gözden geçirmektir; bu mesafeler, biyomoleküllerin yapısal modellerini oluşturmak için kullanılabilir. İlk deneysel doğrulamaFRET verimliliğine R - 6 bağımlılığının bağımlılığı, 1967&#39;de Stryer tarafından 10 &quot;spektroskopik cetvel&quot; olarak çeşitli uzunluklarda poliprolinlerin ölçülmesi ile gerçekleştirildi. Benzer bir deney, 2005 yılında tek molekül seviyesinde başarılmıştır 11 . Poliprolin molekülleri ideal olmayan oldukları ortaya çıkmış ve bu nedenle çift sarmallı DNA molekülleri daha sonra kullanılmıştır 12 . Bu, kesin uzaklık ölçümleri için pencereyi açtı ve biyomoleküllerin yapısal özelliklerini tanımlamak için FRET&#39;in kullanılması fikrini verdi. FRET, boyanacak mesafe aralığı ~ 0.6-1.3 R 0 arasındayken optimaldir, burada R 0 Förster mesafesidir. Tek moleküllü FRET deneylerinde kullanılan tipik fluoroforlar için R 0 ~ 50 A&#39;dır. Tipik olarak FRET, yapıları ve dinamikleri çözme ve ayırma becerisi bakımından diğer yöntemlere göre birçok avantaj sunmaktadırHeterojen sistemler: (i) Floresansın nihai hassasiyetinden dolayı, tek moleküllü FRET deneyleri 13 , 14 , 15 , 16 heterojen toplulukları bireysel üyelerin yapılarını doğrudan sayarak ve aynı anda karakterize ederek çözümleyebilir. (Ii) Kompleks reaksiyon yolakları tek moleküllü FRET çalışmalarında doğrudan çözülebilir, çünkü bir toplulukta senkronizasyona ihtiyaç yoktur. (Iii) FRET, biyolojik olarak ilgili dinamikleri içeren geniş bir yelpazede, zaman içinde 10 yılı aşan geniş bir zaman alanlarına erişebilir. (Iv) FRET deneyleri, in vitro olarak ve in vivo olarak herhangi bir çözelti koşulunda gerçekleştirilebilir. FRET&#39;in flüoresans mikroskobu ile kombinasyonu, canlı hücrelerdeki moleküler yapıların ve etkileşimlerin incelenmesine olanak tanır 15 , 16 , </<html> &gt; 17 , 18 , 19 , hatta yüksek hassasiyetle 20 . (V) FRET , neredeyse her boyutta ( örneğin, poliprolin oligomerler 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , HIV revers transkriptaz 26 ve ribozomlar 27 ) uygulanabilir. (Vi) Son olarak, biyomoleküllerin tüm boyutlarını içeren mesafeler ağı, statik veya dinamik moleküllerin 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref &quot;&gt; 35 , 36 , 37 . Bu nedenle, tek moleküllü FRET spektroskopisi, mesafeye göre sınırlandırılmış yapısal modellemede kullanılabilecek kadar hassas mesafeler türetmek için kullanılabilir. Bu, flüoresans bilgisinin sekiz boyutunu ( yani uyarma spektrumu, floresans spektrumu, anizotropi, floresans ömrü, floresan kuantum verimi, Makroskopik zaman, flüoresans yoğunlukları ve flüoroforlar arasındaki mesafe) doğru ve tam olarak mesafe sınırlamaları sağlar. Buna ek olarak, darbeli araya sokulan uyarılma (PIE), MFD(PIE-MFD) 42 ile direkt uyarım akseptörünün flüoresansını izlemek ve 1: 1 donör-toplayıcı stokiyometri içeren numunelerden kaynaklanan tek molekül olaylarını seçmek için kullanılmıştır. Tipik bir PIE-MFD kurulumu, foton algılamanın farklı spektral pencerelerde ve kutuplama özelliklerinde dört farklı kanala ayrıldığı bir konfokal mikroskop gövdesine bağlı iki palslı araya sokulmuş uyarma lazerleri kullanır. Daha fazla ayrıntı Şekil 1&#39;de bulunabilir . FRET&#39;in 26 , 30 FRET sonuçları ile uyumlu atomistik benzeri yapısal modelleri elde etmek için FRET&#39;in hesaplama yöntemleriyle birleştirilmesi gerektiğini unutmamak önemlidir. Mevcut protokolün amacı, FRET kaynaklı mesafelerde yapısal modeller oluşturmak için ilgili metodolojiyi gözden geçirmek değildir. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar diğer tekniklerle ( örn. Küçük açılı X ışını saçılmasıIng ya da elektron paramanyetik rezonans), bütünleyici yapısal biyoloji alanını doğuruyor 43 , 44 , 45 , 46 . Halihazırdaki amaç yapısal biyolojide nicel bir araç olarak FRET&#39;in yolunu açmaktır. Bir örnek olarak, bu metodoloji, N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörünün ligand bağlama alanındaki (LBD) üç konformasyonel durumu tanımlamak için kullanıldı. Nihai amaç, belirtilen sınırlamaları aşmak ve FRET&#39;i, yüksek hassasiyette ölçülen mesafeler sağlayarak biyomoleküllerin yapısal belirlenmesi için kullanılan bütünleştirici yöntemler arasında getirmektir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">charcoal</td>
			<td style="width:183px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:119px;">K42964486 320</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">syringe filter</td>
			<td style="width:183px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">09-719C</td>
			<td>size: 0.20um</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">chambered coverglass</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">155409</td>
			<td>1.5 borosilicate glass, 8 wells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">microscope cover glass</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">063014-9</td>
			<td>size: 24X60-1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">148859</td>
			<td>nuclease free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">tween-20</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28320</td>
			<td>10% solution of Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">acceptor DNA strand (High FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">178124895</td>
			<td>5&#180;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">acceptor DNA strand (Low FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">177956424</td>
			<td>5&#180;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">donor DNA strand</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">177951437</td>
			<td>5&#180; -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">DNA strand (No FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>5&#180; -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">thermal cycler</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">E6331000025</td>
			<td>nexus gradient</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Alexa Fluor 488 C5&#160;Maleimide</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A10254</td>
			<td>termed cyan-green fluorophore in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Alexa Fluor 647 C2&#160;Maleimide</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A20347</td>
			<td>termed far-red fluorophore in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Rhodamine 110</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83695-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Rhodamine 101</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83694-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1426</td>
			<td>For culture of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A0166</td>
			<td>Used at 100 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Tetracyline&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">58346</td>
			<td>Used at 12.5 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP906-5</td>
			<td>Used at 15 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Origami B(DE3) Competent Cells</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">70837-3</td>
			<td>Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1755</td>
			<td>For induction of E. coli protein expression</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">HiTrap Chelating HP</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0409-01</td>
			<td>For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Imidazole</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">56749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Ni-NTA Agarose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PD-10 Desalting Column</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">AktaPurifier</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28406264</td>
			<td>FPLC Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Dialysis tubing</td>
			<td style="width:183px;">Spectrum labs</td>
			<td style="width:119px;">132562</td>
			<td>15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Dichroics</td>
			<td style="width:183px;">Semrock</td>
			<td style="width:119px;">FF500/646-Di01-25x36</td>
			<td>500/646 BrightLight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">50/50 Beam splitter polarizer</td>
			<td style="width:183px;">Qioptiq Linos&#160;</td>
			<td style="width:119px;">G33 5743 000</td>
			<td>10x10 film polarizer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Green pass filer</td>
			<td style="width:183px;">Chroma</td>
			<td style="width:119px;">ET525/50m</td>
			<td style="width:167px;">ET525/50m 25 mm diameter mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Red pass filter</td>
			<td style="width:183px;">Chroma</td>
			<td>ET720/150m</td>
			<td>ET720/150m 25 mm diameter mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Power Meter</td>
			<td style="width:183px;">ThorLabd</td>
			<td style="width:119px;">PM200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:183px;">Varian</td>
			<td style="width:119px;">Cary300Bio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fluorolog 3 fluorometer</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">FL3-22-R3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fluorohub TCSPC controller</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">Fluorohub-B</td>
			<td>TCSPC electronics for ensemble measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">NanoLed 485L</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">485L</td>
			<td>Blue diode laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">NanoLed 635L</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">635L</td>
			<td>Red diode laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Olympus IX73 Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX73P2F</td>
			<td>Microscope frame</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PMA 40 Hybrid Detector</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">932200, PMA 40</td>
			<td>Optimized for green detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PMA 50 Hybrid Detector</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">932201, PMA 50</td>
			<td>Optimized for ed shifter sensitivity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">485nm laser</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">LDH-D-C-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">640nm laser</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">LDH-D-C-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Hydraharp 400 and TTTR acqusition software</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant</td>
			<td align="right" style="width:119px;">930021</td>
			<td>Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">SEPIA II SLM 828 and SEPIA software</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant</td>
			<td align="right" style="width:119px;">910028</td>
			<td>Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">computer</td>
			<td style="width:183px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">optiplex 7010</td>
			<td>cpu: i7-3770 ram:16GB</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">FRET Positioning and Screening (FPS) software</td>
			<td style="width:183px;">Heinrich Heine Unviersity</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">MFD suite</td>
			<td style="width:183px;">Heinrich Heine Unviersity</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high precision fret at single-molecule level for biomolecule structure determination

Çok parametreli flüoresan algılama (MFD) modunda tek molekül seviyesinde Förster rezonans enerji transferi (FRET) kullanılarak yüksek hassasiyetli boyacılar arası mesafe ölçümlerinin nasıl yapılacağı üzerine bir protokol burada sunulmuştur. MFD, fotofizik ve deneysel eserleri azaltmak için flüoresanın tüm &quot;boyutlarını&quot; maksimize eder ve rijid biyomoleküllerde ~ 1Å kadar bir doğrulukla boyarmadde mesafe ölçümünü sağlar. Bu yöntem, ligand bağlanması üzerine reseptörün aktivasyonunu açıklamak için N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörünün ligand bağlama alanının üç konformasyonel durumunun tanımlanması için kullanılmıştır. Bilinen kristalografik yapıları deneysel ölçümlerle karşılaştırırken, daha dinamik biyomoleküller için 3 A&#39;dan küçük bir alan üzerinde anlaşmışlardır. Biyomoleküllerin tüm boyutlarını kapsayan bir dizi mesafe sınırlamaları toplamak dinamik biyomolekülün yapısal bir modelini mümkün kılabilires.

Bir MFD kurulumu (lazer çizgileri: 60 μW&#39;da 485 nm ve 23 μW&#39;da 640 nm, bölüm 5.1) kullanan tipik smFRET deneylerinde, floresans numunesi düşük pikomolar konsantrasyonda ( 10-12 M = 1 pM) seyreltilir ve Bir alt-nanosaniyelik lazer darbesinin uyarı hacmi boyunca serbestçe dağılmış etiketli molekülleri uyaran bir konfokal mikroskopta. Tipik bir konfokal hacim &lt;4 femtolitre (fL) &#39;dir. Düşük konsantrasyonlarda, tek seferde tek bir molekül tespit ed...

Watch this Scientific Journal Video about High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination at JoVE.com

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Tek molekül seviyesinde yüksek hassasiyetli FRET deneyleri için bir protokol burada sunulmuştur. Buna ek olarak, bu metodoloji, N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörünün ligand bağlama alanındaki üç konformasyonel durumu tanımlamak için kullanılabilir. Kesin mesafelerin belirlenmesi FRET deneylerine dayanan yapısal modellerin oluşturulmasına yönelik ilk adımdır.

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Tek molekülün yapısal bilgiler Hızlı Nano konumlandırma Sisteminin Kullanılması Deneyler FRET

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Basit, sağlam ve yüksek üretilen iş tek bir molekül akışı germe tahlil uygulama boyunca DNA moleküllerinin taşıma eğitimi için

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

G-quadruplexes manyetik cımbız tarafından manipülasyon tek molekül

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Yüksek işlem hacmi, mutlak nicel nokta kullanarak doku düzeyleri, seçili bir Protein içeriği tayini Blot Analizi (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Üç renkli tek molekül FRET Protein etkileşimleri korelasyon çalışma için kullanma

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Açık Kaynaklı smfBox kullanarak Hassas ve Doğru Tek Moleküllü FRET Ölçümleri Yapma

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

DNA Üzerine Birleştirilen EWS-FLI1 Kondensatlarının Tek Moleküllü Görüntülenmesi

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...