Name: lerlic-ms/ms for in-depth characterization and quantification of glutamine and asparagine deamidation in shotgun proteomics
Uploaded: 2017-04-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics at JoVE.com

עבודה זו באופן חלקי בסיוע מענקים ממשרד סינגפור החינוך (Tier 2: גרנט ARC9 / 15), לאומי המועצה למחקר רפואי של סינגפור (NMRC-OF-IRG-0003-2016), ו NTU-NHG הזדקנות מחקר גרנט ( גרנט ARG / 14,017). ברצוננו להביע את תודתנו ותודה הכנה ביותר ד&quot;ר אנדרו אלפרט וצוות PolyLC עבור ספק לנו בחביבות עם חומרי האריזה מתאפשרים במחקר זה.

1. אריזה-אניוני לטווח האורך (LAX) טור נימים (הערה: למרות טור LAX יכול להיות בתוך הבית הארוז כפי שאנו מתארים בפרוטוקול זה, עמודות LAX זמינות גם מסחרי, ראה טבלה של חומרים ריאגנטים לפרטים נוספים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-a...

<ol>
	<li>Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+mass+spectrometric+analysis+of+protein+deamidation.">Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation.</a> Mass Spectrom Rev. , (2016).</li><li>Geiger, T., Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deamidation,+isomerization,+and+racemization+at+asparaginyl+and+aspartyl+residues+in+peptides.+Succinimide-linked+reactions+that+contribute+to+protein+degradation.">Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation.</a> J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).</li><li>Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Glutamine+Deamidation+by+Long-Length+Electrostatic+Repulsion-Hydrophilic+Interaction+Chromatography-Tandem+Mass+Spectrometry+(LERLIC-MS/MS)+in+Shotgun+Proteomics.">Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics.</a> Anal Chem. , (2016).</li><li>Reissner, K. J., Aswad, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deamidation+and+isoaspartate+formation+in+proteins:+unwanted+alterations+or+surreptitious+signals.">Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals.</a> Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).</li><li>Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+evidence+of+spontaneous+deamidation+of+glutamine+residue+via+cyclic+imide+to+[small+alpha]-+and+[gamma]-glutamic+residue+under+physiological+conditions.">First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions.</a> JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).</li><li>Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+extracellular+vesicles+from+tissues+of+the+central+nervous+system+by+PROSPR.">Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR.</a> Mol Neurodegener. 11 (1), 41 (2016).</li><li>Gallart-Palau, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+differences+in+white+matter+pathology+and+mitochondrial+dysfunction+in+Alzheimer's+disease+with+cerebrovascular+disease.">Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease with cerebrovascular disease.</a> Mol Brain. 9, 27 (2016).</li><li>Gallart-Palau, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+lobe+proteins+implicated+in+synaptic+failure+exhibit+differential+expression+and+deamidation+in+vascular+dementia.">Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia.</a> Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).</li><li>Robinson, N. E., Robinson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+clocks.">Molecular clocks.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).</li><li>Hao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+separation+and+characterization+of+deamidated+peptides+with+RP-ERLIC-based+multidimensional+chromatography+coupled+with+tandem+mass+spectrometry.">Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).</li><li>Li, X., Lin, C., O'Connor, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+deamidation:+differentiation+of+glutamic+acid+and+gamma-glutamic+acid+in+peptides+by+electron+capture+dissociation.">Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation.</a> Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Serra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+proteome+coverage+is+increased+by+unique+peptide+recovery+from+sodium+deoxycholate+precipitate.">Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate.</a> Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).</li><li>Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+Neurodegenerative+Protein+Modifications+via+Proteomic+Profiling.">Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling.</a> Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).</li><li>Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antibody+Fc+deamidation+in+vivo.">Human antibody Fc deamidation in vivo.</a> Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).</li><li>Serra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commercial+processed+soy-based+food+product+contains+glycated+and+glycoxidated+lunasin+proteoforms.">Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms.</a> Sci Rep. 6, 26106 (2016).</li><li>Serra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+peptidomic+strategy+to+decipher+the+molecular+diversity+of+cyclic+cysteine-rich+peptides.">A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides.</a> Sci Rep. 6, 23005 (2016).</li><li>Leo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deamidation+at+asparagine+and+glutamine+as+a+major+modification+upon+deterioration/aging+of+proteinaceous+binders+in+mural+paintings.">Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings.</a> Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).</li><li>Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+extent+of+bone+degradation+using+glutamine+deamidation+in+collagen.">Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen.</a> Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).</li><li>Buszewski, B., Noga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophilic+interaction+liquid+chromatography+(HILIC)--a+powerful+separation+technique.">Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)--a powerful separation technique.</a> Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).</li><li>Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anion-exchange+chromatography+of+phosphopeptides:+weak+anion+exchange+versus+strong+anion+exchange+and+anion-exchange+chromatography+versus+electrostatic+repulsion-hydrophilic+interaction+chromatography.">Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography.</a> Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).</li><li>Adav, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dementia-linked+amyloidosis+is+associated+with+brain+protein+deamidation+as+revealed+by+proteomic+profiling+of+human+brain+tissues.">Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues.</a> Mol Brain. 9 (1), 20 (2016).</li><li>Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinking+laterally+about+neurodegenerative+proteinopathies.">Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies.</a> J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).</li><li>Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+expressing+human+SOD1+successfully+recapitulates+mitochondrial+phenotypic+features+of+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).</li><li>Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+in+vitro+and+in+vivo+stability+of+a+succinimide+intermediate+observed+on+a+therapeutic+IgG1+molecule.">Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule.</a> mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+functional+implication+of+a+stable+succinimide+in+the+structural+stability+of+Methanocaldococcus+jannaschii+glutaminase.">Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase.</a> Nat Commun. 7, 12798 (2016).</li><li>Alpert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+Repulsion+Hydrophilic+Interaction+Chromatography+for+Isocratic+Separation+of+Charged+Solutes+and+Selective+Isolation+of+Phosphopeptides.">Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides.</a> Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).</li><li>Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection,+Evaluation+and+Minimization+of+Nonenzymatic+Deamidation+in+Proteomic+Sample+Preparation.">Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111 (2011).</li><li>Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+effect+of+trypsin+digestion+buffers+on+artificial+deamidation.">Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation.</a> J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).</li><li>Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mildly+acidic+conditions+eliminate+deamidation+artifact+during+proteolysis:+digestion+with+endoprotease+Glu-C+at+pH+4.5.">Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5.</a> Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).</li></ol>

In-מאמר בסרטון הזה אנחנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד של LERLIC-MS / MS 3, שיטה לבצע אפיון מעמיק כדי לקבוע את המידה במדויק deamidation חלבון לבין תהליכים אנזימטיים מעורבים על שינוי חלבון זה. LERLIC-MS / MS מבוסס על השימוש באורך-ארוך (50 ס&quot;מ) LAX תחת העיקרון של כרומטוגרפיה אינט?...

Deamidation הוא שינוי posttranslational חלבון (PTM) המציג מטען שלילי לשדרת חלבון באמצעות שינוי של asparagine (ASN) ו / או גלוטמין (GLN) שאריות 1. שינוי זה תוך העמדת פנים שהם שאריות ASN מייצר חומצת isoaspartic מוצרים isomeric (isoAsp) ו- n חומצה -aspartic (ASP) בבית 3 המשותף: יחס 1 2. עם זאת, יחס זה ניתן לשינוי על ידי התערבות של methyltransferase L-isoaspartyl אנזים תיקון (PIMT) 3, 4. באופן דומה, deamidation של שאריות GLN מייצר חומצת isomeric גלוטמית-גמא (γ-Glu) ו isoforms חומצה גלוטמית-אלפא (α-Glu) במכירה צפוי 1: 7 יחס 3, 5, אך יחס זה יכול להיות מוזז על ידי פעולה של transglutaminase האנזים נמצא בכל מקום 2 ו transglutaminases אחר, כולל transglutaminase 1, דוארnzyme זיהה לאחרונה הקשורים שלפוחית תאית במוח 6. מקורו של deamidation יכול להיות ספונטני או אנזימטי, לשעבר נפוץ במיוחד על שאריות GLN שבו transglutaminases ואנזימים אחרים לתווך בין / crosslinking תוך המולקולרי באמצעות transamidation (ראה 3 לפרטים נוספים על GLN transamidation וההשלכות בכמה כרוני מחל אנושיות קטלניות). לכן, deamidation הוא PTM שיש לו השלכה מכרעת על המבנה ותפקוד של מולקולות מושפעות 4, 7, 8 ו דורש אפיון כימי מעמיק 3 לאור השלכות ביוכימיים המגוונים שלה כולל השירות שלה כמו שעון מולקולרי של הזדקנות 9 . למרות deamidation של שאריות ASN כבר<html> יחסית היטב מאופיין פרוטאומיקה רובה מלמטה למעלה 1, 10, deamidation של שאריות GLN עדיין אין שיטה לאפיון מתאימה מעבר לניתוח המאתגר של תרכובות מודל ידי קיטוע רדיקלי מבוסס אלקטרונים 11. פיתחנו לאחרונה אסטרטגיית פרוטאומיקה רובה אחד-מימד רומן (LERLIC-MS / MS) 3 המאפשרת הפרדה של isoforms deamidation GLN ו ASN מ דגימות ביולוגיות מורכבות תרכובות המודל בניתוח יחיד. LERLIC-MS / MS מבוסס על הפרדת פפטידים מתעכל tryptic באמצעות אורך-ארוך (50 ס&quot;מ) טור חילוף יונים (LAX) עובד על כרומטוגרפיה אינטראקציה ודחייה-הידרופיליות אלקטרוסטטית (ERLIC) מצב מצמידים ספקטרומטריית מסה טנדם (LC- MS / MS). אסטרטגיה אנליטית חדשה זו שימשה לאפיין יחסית לכמת את מידת כל שאריות deamidated ברקמות המוח האנושיf &quot;&gt; 3. עם זאת, הפרוטוקול המתואר כאן יספק הדמיה וידאו של LERLIC-MS / MS נסיון לבדוק את הייחוד של חלבון deamidation בהקשר ביוכימיים של עניין. אמירה אתית כל הנהלים של פרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית של האוניברסיטה הטכנולוגית נניאנג בסינגפור בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1053">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PolyCAT 3&#181;m 100-&#197; (bulk material)</td>
			<td style="width:424px;">PolyLC Inc.</td>
			<td style="width:207px;">Special order</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Long-length ion exchange capillary column 50 cm - 200 &#181;m ID</td>
			<td style="width:424px;">PolyLC Inc.</td>
			<td style="width:207px;">Special order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PEEKsil Tubing 1/16&#34; OD x 200 &#181;m ID x 50 cm length</td>
			<td>SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia&#160;</td>
			<td style="width:207px;">620050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Female-to-female fitting for 1/16&#34; OD tubbing</td>
			<td>Upchurch Scientific</td>
			<td style="width:207px;">UPCHF-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Female nut for microferule</td>
			<td>Upchurch Scientific</td>
			<td style="width:207px;">UPCHP-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Microferule</td>
			<td>Upchurch Scientific</td>
			<td style="width:207px;">UPCHF-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pressure Bomb NanoBaume</td>
			<td style="width:424px;">Western Fluids Engineering</td>
			<td style="width:207px;">SP-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Shimadzu Prominence UFLC system</td>
			<td style="width:424px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:207px;">Prominence UFLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Bullet Blender</td>
			<td style="width:424px;">Next Advance</td>
			<td style="width:207px;">BBX24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Safe-lock tubes</td>
			<td style="width:424px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td>T9661-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel beads. 0.9 &#8211; 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile.</td>
			<td style="width:424px;">Next Advance</td>
			<td>SSB14B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Table-top centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:424px;">Hettich Zentrifugen</td>
			<td style="width:207px;">Rotina 380 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC</td>
			<td style="width:424px;">PolyScience 8006 6L</td>
			<td style="width:207px;">8006A11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg</td>
			<td style="width:424px;">Waters</td>
			<td style="width:207px;">WAT020805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Vacumm concentrator</td>
			<td style="width:424px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Concentrator Plus System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Dionex UltiMate 3000 UHPLC&#160;</td>
			<td style="width:424px;">Dionex</td>
			<td style="width:207px;">UltiMate 3000 UHPLC&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Orbitrap Elite mass spectrometer</td>
			<td style="width:424px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:207px;">ORBITRAP ELITE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Michrom Thermo CaptiveSpray&#160;</td>
			<td style="width:424px;">Michrom-Bruker Inc.</td>
			<td style="width:207px;">TCSI-SS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Incubator INCUCELL&#160;</td>
			<td style="width:424px;">MMM Group</td>
			<td style="width:207px;">INCUCELL111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sequencing-grade modified trypsin</td>
			<td style="width:424px;">Promega</td>
			<td style="width:207px;">V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:424px;">Roche</td>
			<td style="width:207px;">11836170001 (ROCHE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Phosphate buffer solution 10X (diluted to 1x)</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Ammonium acetate</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">A1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">i6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Formic acid</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">F0507 (HONEYWELL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">338818 (HONEYWELL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Acetonitrile HPLC grade</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">675415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Isopropanol HPLC grade</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">675431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Water HPLC grade</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">14263</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lerlic-ms/ms for in-depth characterization and quantification of glutamine and asparagine deamidation in shotgun proteomics

אפיון של חלבון deamidation הוא הכרחי כדי לפענח את התפקיד (ים) ועל פוטנציאל של שינוי posttranslational חלבון זה (PTM) בפתולוגיה האנושית בהקשרים ביוכימיים אחרים. על מנת לבצע אפיון של חלבון deamidation, אנו לאחרונה פיתחו ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה-טנדם אינטראקציה ודחייה-הידרופיליות אלקטרוסטטית לטווח אורך הרומן (LERLIC-MS / MS) שיטה שיכולה להפריד בין גלוטמין (GLN) ו asparagine (ASN) איזופורם מוצרים של deamidation מן תרכובות מודל דגימות ביולוגיות מורכבות מאוד. LERLIC-MS / MS היא, אפוא, אסטרטגית פרוטאומיקה הרובה הראשונה להפרדה וכימות של isoforms deamidation GLN. אנחנו גם להפגין, כחידוש, כי פרוטוקול עיבוד מדגם המתוארות כאן מייצב את ביניים succinimide המאפשר אפיון שלה על ידי LERLIC-MS / MS. יישום של LERLIC-MS / MS כפי שמוצג במאמר זה וידאו יכול לעזור כדי להבהיר את כרגע unknowמערכים מולקולריים n של deamidation חלבון. בנוסף, LERLIC-MS / MS מספקת הבנה נוספת של תגובות אנזימטיות כי להקיף deamidation ב רקע ביולוגי מובהק.

Deamidation של שאריות GLN ו ASN נחשב שינוי חלבון ניוונית (DPM) מעורב בכמה מחלות כרוניות קטלנית 14. הוכח כי PTM זה יכול לחזות את המדינות חצי-חי degradative של נוגדנים ומולקולות אחרות בגוף האדם ורקעים ביולוגיים דומים 1, 15. המשמ...

Watch this Scientific Journal Video about LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics at JoVE.com

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

כאן אנו מציגים צעד-אחר-צעד פרוטוקול של דחייה-הידרופיליות אלקטרוסטטית באורך ארוך אינטראקציה-טנדם כרומטוגרפיה ספקטרומטריית מסה (LERLIC-MS / MS) שיטה. זוהי שיטה חדשנית המאפשרת כימות לראשונה ואפיון של isoforms deamidation גלוטמין ו asparagine ידי פרוטאומיקה רובה.

LERLIC-MS / MS עבור אפיון מעמיק וכימות של גלוטמין ו asparagine Deamidation ב פרוטאומיקה Shotgun

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

אפיון של Glycoproteins עם הקיפול בנוגדנים על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן וטכניקות ביופיזיקלי

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

מחייב סומו ישויות (SUBEs) ככלים עבור העשרה, בידוד, זיהוי, ואפיון של פרוטאום סומו בסרטן הכבד

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

קוונפיקציה של קואנזים A בתאים ורקמות

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

הכנה לדוגמא להגשת מתקנים פרוטאומניקס וניתוח נתונים שלאחר מכן

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

JUMPn: A Streamlined Application for Protein Co-Expression Clustering and Network Analysis in Proteomics

JUMPn: יישום יעיל עבור אשכולות ביטוי משותף של חלבונים וניתוח רשת בפרוטאומיקה

With recent advances in mass spectrometry-based proteomics technologies, deep profiling of hundreds of proteomes has become increasingly feasible. ...

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

רובה ציד Proteomics עיבוד מדגם אוטומטי על ידי רובוט מעבדה קוד פתוח

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

Shotgun Lipidomics של רקמות מכרסם

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have ...