Name: lerlic-ms/ms for in-depth characterization and quantification of glutamine and asparagine deamidation in shotgun proteomics
Uploaded: 2017-04-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics at JoVE.com

Este trabalho foi em parte apoiado por subsídios do Ministério da Educação de Cingapura (Tier 2: Conceder ARC9 / 15), National Medical Research Council of Singapore (NMRC-OF-IRG-0003-2016) e NTU-NHG Aging Research Grant ( Grant ARG / 14017). Nós gostaríamos de expressar nossa gratidão e mais sinceros agradecimentos ao Dr. Andrew Alpert e equipe PolyLC para gentilmente nos cedeu os materiais de embalagem que tornaram possível este estudo.

1. Embalagem O ani-intercâmbio de longa-metragem Coluna (LAX) Capilar (Nota: Embora a coluna LAX pode estar em casa-embalados como descrevemos neste protocolo, LAX colunas estão também disponíveis comercialmente, ver Tabela de Materiais e Reagentes para mais detalhes). <ol><li> Suspender 50 mg de material de embalagem de permuta aniónica fraca em 3,5 mL de tampão de embalagem (Tabela 1) para preparar a suspensão. </li><li> Montar a extremid...

<ol>
	<li>Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+mass+spectrometric+analysis+of+protein+deamidation.">Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation.</a> Mass Spectrom Rev. , (2016).</li><li>Geiger, T., Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deamidation,+isomerization,+and+racemization+at+asparaginyl+and+aspartyl+residues+in+peptides.+Succinimide-linked+reactions+that+contribute+to+protein+degradation.">Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation.</a> J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).</li><li>Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Glutamine+Deamidation+by+Long-Length+Electrostatic+Repulsion-Hydrophilic+Interaction+Chromatography-Tandem+Mass+Spectrometry+(LERLIC-MS/MS)+in+Shotgun+Proteomics.">Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics.</a> Anal Chem. , (2016).</li><li>Reissner, K. J., Aswad, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deamidation+and+isoaspartate+formation+in+proteins:+unwanted+alterations+or+surreptitious+signals.">Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals.</a> Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).</li><li>Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+evidence+of+spontaneous+deamidation+of+glutamine+residue+via+cyclic+imide+to+[small+alpha]-+and+[gamma]-glutamic+residue+under+physiological+conditions.">First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions.</a> JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).</li><li>Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+extracellular+vesicles+from+tissues+of+the+central+nervous+system+by+PROSPR.">Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR.</a> Mol Neurodegener. 11 (1), 41 (2016).</li><li>Gallart-Palau, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+differences+in+white+matter+pathology+and+mitochondrial+dysfunction+in+Alzheimer's+disease+with+cerebrovascular+disease.">Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease with cerebrovascular disease.</a> Mol Brain. 9, 27 (2016).</li><li>Gallart-Palau, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+lobe+proteins+implicated+in+synaptic+failure+exhibit+differential+expression+and+deamidation+in+vascular+dementia.">Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia.</a> Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).</li><li>Robinson, N. E., Robinson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+clocks.">Molecular clocks.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).</li><li>Hao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+separation+and+characterization+of+deamidated+peptides+with+RP-ERLIC-based+multidimensional+chromatography+coupled+with+tandem+mass+spectrometry.">Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).</li><li>Li, X., Lin, C., O'Connor, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+deamidation:+differentiation+of+glutamic+acid+and+gamma-glutamic+acid+in+peptides+by+electron+capture+dissociation.">Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation.</a> Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Serra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+proteome+coverage+is+increased+by+unique+peptide+recovery+from+sodium+deoxycholate+precipitate.">Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate.</a> Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).</li><li>Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+Neurodegenerative+Protein+Modifications+via+Proteomic+Profiling.">Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling.</a> Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).</li><li>Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antibody+Fc+deamidation+in+vivo.">Human antibody Fc deamidation in vivo.</a> Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).</li><li>Serra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commercial+processed+soy-based+food+product+contains+glycated+and+glycoxidated+lunasin+proteoforms.">Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms.</a> Sci Rep. 6, 26106 (2016).</li><li>Serra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+peptidomic+strategy+to+decipher+the+molecular+diversity+of+cyclic+cysteine-rich+peptides.">A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides.</a> Sci Rep. 6, 23005 (2016).</li><li>Leo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deamidation+at+asparagine+and+glutamine+as+a+major+modification+upon+deterioration/aging+of+proteinaceous+binders+in+mural+paintings.">Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings.</a> Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).</li><li>Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+extent+of+bone+degradation+using+glutamine+deamidation+in+collagen.">Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen.</a> Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).</li><li>Buszewski, B., Noga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophilic+interaction+liquid+chromatography+(HILIC)--a+powerful+separation+technique.">Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)--a powerful separation technique.</a> Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).</li><li>Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anion-exchange+chromatography+of+phosphopeptides:+weak+anion+exchange+versus+strong+anion+exchange+and+anion-exchange+chromatography+versus+electrostatic+repulsion-hydrophilic+interaction+chromatography.">Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography.</a> Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).</li><li>Adav, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dementia-linked+amyloidosis+is+associated+with+brain+protein+deamidation+as+revealed+by+proteomic+profiling+of+human+brain+tissues.">Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues.</a> Mol Brain. 9 (1), 20 (2016).</li><li>Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinking+laterally+about+neurodegenerative+proteinopathies.">Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies.</a> J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).</li><li>Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+expressing+human+SOD1+successfully+recapitulates+mitochondrial+phenotypic+features+of+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).</li><li>Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+in+vitro+and+in+vivo+stability+of+a+succinimide+intermediate+observed+on+a+therapeutic+IgG1+molecule.">Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule.</a> mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+functional+implication+of+a+stable+succinimide+in+the+structural+stability+of+Methanocaldococcus+jannaschii+glutaminase.">Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase.</a> Nat Commun. 7, 12798 (2016).</li><li>Alpert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+Repulsion+Hydrophilic+Interaction+Chromatography+for+Isocratic+Separation+of+Charged+Solutes+and+Selective+Isolation+of+Phosphopeptides.">Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides.</a> Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).</li><li>Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection,+Evaluation+and+Minimization+of+Nonenzymatic+Deamidation+in+Proteomic+Sample+Preparation.">Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111 (2011).</li><li>Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+effect+of+trypsin+digestion+buffers+on+artificial+deamidation.">Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation.</a> J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).</li><li>Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mildly+acidic+conditions+eliminate+deamidation+artifact+during+proteolysis:+digestion+with+endoprotease+Glu-C+at+pH+4.5.">Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5.</a> Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).</li></ol>

Neste vídeo-artigo apresentamos um protocolo passo-a-passo de LERLIC-MS / MS 3, um método para realizar uma caracterização em profundidade e para determinar com precisão a extensão da desamidação da proteína e os processos enzimáticos envolvidos nesta modificação de proteínas. LERLIC-MS / MS baseia-se no uso de um longo comprimento (50 cm) LAX sob o princípio de cromatografia electrostática repulsão-hidrofílico interacção (ERLIC) 27. A utilização de um...

A desamidação é uma modificação pós-tradução da proteína (PTM), que introduz uma carga negativa para o esqueleto da proteína através da modificação de asparagina (Asn) e / ou resíduos de glutamina (Gln) 1. Esta modificação, enquanto que afectam os resíduos Asn gera a produtos isoméricos ácido isoaspartic (isoAsp) e n ácido aspártico (Asp) a um comum proporção de 3: 1 2. Não obstante, esta proporção pode ser alterada pela intervenção da enzima de reparação de L-isoaspartyl metiltransferase (PIMT) 3, 4. Da mesma forma, a desamidação de resíduos Gln gera o ácido isomérica gama-glutâmico (γ-Glu) e isoformas de ácido alfa-glutâmico (α-Glu) a uma esperada razão de 1: 7 3, 5, mas esta proporção pode ser deslocado por acção de a transglutaminase ubíqua enzima 2 e outras transglutaminases, incluindo uma transglutaminase, uma mensagemnzyme recentemente identificada como associada com vesículas extracelulares no cérebro 6. A origem de desamidação pode ser espontânea ou enzimática, o primeiro é especialmente comum em resíduos de Gln em que as transglutaminases e outras enzimas medeiam reticulação / intra-molecular entre através de transamidação (ver 3 para mais detalhes sobre Gln transamidação e suas implicações em várias crónica e doenças humanas fatais). Portanto, desamidação é um PTM que tem uma repercussão crucial sobre a estrutura e função das moléculas afectadas 4, 7, 8 e requer uma caracterização química em profundidade 3 em função das suas diversas consequências bioquímicas incluindo o seu serviço de relógio como molecular de envelhecimento 9 . Embora desamidação de resíduos Asn tem sido<html> relativamente bem caracterizados por proteómica espingarda de baixo para cima 1, 10, desamidação de resíduos Gln ainda não tem um método de caracterização adequada para além da análise de um desafio por compostos modelo à base de electrões fragmentação radical 11. Nós desenvolvemos recentemente um novo uma dimensão proteómica espingarda estratégia (LERLIC-MS / MS) 3 que permite a separação de Gln e Asn isoformas de desamidação em amostras biológicas complexas e compostos modelo em uma única análise. LERLIC-MS / MS baseia-se na separação de péptidos trípticos digerido usando um longo comprimento (50 cm) de coluna de permuta iónica (LAX) que trabalha no modo de cromatografia de interacção electrostática repulsão-hidrofílico (ERLIC) e acoplada a espectrometria de massa em tandem (LC- MS / MS). Esta nova estratégia de análise foi usado para caracterizar e quantificar relativamente a extensão de cada resíduo desamidada nos tecidos cerebrais humanosf &quot;&gt; 3. No entanto, o protocolo delineado aqui vai fornecer imagens de vídeo de LERLIC-MS / MS visa estudar as peculiaridades de desamidação proteína no contexto bioquímica de interesse. DECLARAÇÃO DE ÉTICA Todos os procedimentos deste protocolo ter sido aprovado pelo conselho de revisão institucional da Universidade Tecnológica de Nanyang, em Cingapura e foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1053">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PolyCAT 3&#181;m 100-&#197; (bulk material)</td>
			<td style="width:424px;">PolyLC Inc.</td>
			<td style="width:207px;">Special order</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Long-length ion exchange capillary column 50 cm - 200 &#181;m ID</td>
			<td style="width:424px;">PolyLC Inc.</td>
			<td style="width:207px;">Special order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PEEKsil Tubing 1/16&#34; OD x 200 &#181;m ID x 50 cm length</td>
			<td>SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia&#160;</td>
			<td style="width:207px;">620050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Female-to-female fitting for 1/16&#34; OD tubbing</td>
			<td>Upchurch Scientific</td>
			<td style="width:207px;">UPCHF-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Female nut for microferule</td>
			<td>Upchurch Scientific</td>
			<td style="width:207px;">UPCHP-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Microferule</td>
			<td>Upchurch Scientific</td>
			<td style="width:207px;">UPCHF-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pressure Bomb NanoBaume</td>
			<td style="width:424px;">Western Fluids Engineering</td>
			<td style="width:207px;">SP-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Shimadzu Prominence UFLC system</td>
			<td style="width:424px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:207px;">Prominence UFLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Bullet Blender</td>
			<td style="width:424px;">Next Advance</td>
			<td style="width:207px;">BBX24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Safe-lock tubes</td>
			<td style="width:424px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td>T9661-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel beads. 0.9 &#8211; 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile.</td>
			<td style="width:424px;">Next Advance</td>
			<td>SSB14B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Table-top centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:424px;">Hettich Zentrifugen</td>
			<td style="width:207px;">Rotina 380 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC</td>
			<td style="width:424px;">PolyScience 8006 6L</td>
			<td style="width:207px;">8006A11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg</td>
			<td style="width:424px;">Waters</td>
			<td style="width:207px;">WAT020805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Vacumm concentrator</td>
			<td style="width:424px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Concentrator Plus System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Dionex UltiMate 3000 UHPLC&#160;</td>
			<td style="width:424px;">Dionex</td>
			<td style="width:207px;">UltiMate 3000 UHPLC&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Orbitrap Elite mass spectrometer</td>
			<td style="width:424px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:207px;">ORBITRAP ELITE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Michrom Thermo CaptiveSpray&#160;</td>
			<td style="width:424px;">Michrom-Bruker Inc.</td>
			<td style="width:207px;">TCSI-SS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Incubator INCUCELL&#160;</td>
			<td style="width:424px;">MMM Group</td>
			<td style="width:207px;">INCUCELL111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sequencing-grade modified trypsin</td>
			<td style="width:424px;">Promega</td>
			<td style="width:207px;">V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:424px;">Roche</td>
			<td style="width:207px;">11836170001 (ROCHE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Phosphate buffer solution 10X (diluted to 1x)</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Ammonium acetate</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">A1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">i6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Formic acid</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">F0507 (HONEYWELL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">338818 (HONEYWELL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Acetonitrile HPLC grade</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">675415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Isopropanol HPLC grade</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">675431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Water HPLC grade</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">14263</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lerlic-ms/ms for in-depth characterization and quantification of glutamine and asparagine deamidation in shotgun proteomics

Caracterização de desamidação proteína é imperativo para decifrar o papel (s) e as potencialidades desta modificação pós-tradução da proteína (PTM) em patologia humana e outros contextos bioquímicos. A fim de realizar uma caracterização da desamidação proteína, nós desenvolvemos recentemente um longo comprimento electrostática interacção espectrometria de cromatografia em tandem romance repulsão-hidrofílico massa (LERLIC-MS / MS) que pode separar a glutamina (Gln) e asparagina isoforma (Asn) produtos de desamidao de compostos modelo para amostras biológicas altamente complexas. LERLIC-MS / MS é, portanto, a primeira estratégia de proteómica espingarda para a separação e quantificação de isoformas de desamidação Gln. Nós também demonstram, como uma novidade, que o protocolo de processamento da amostra descrito aqui estabiliza o intermediário succinimida permitindo a sua caracterização por LERLIC-MS / MS. Aplicação de LERLIC-MS / MS como mostrado neste artigo de vídeo pode ajudar a elucidar a actualmente desconhecidamatrizes n moleculares de desamidação proteína. Além disso, LERLIC-MS / MS fornece uma maior compreensão das reacções enzimáticas que envolvem desamidação em contextos biológicos distintos.

A desamidação de resíduos Gln e Asn é considerada uma modificação da proteína degenerativa (DPM) implicados em várias doenças crónicas e fatais 14. Tem sido demonstrado que esta PTM pode prever a meia-vida e degradativas estados de anticorpos e outras moléculas no corpo humano e origens biológicas semelhantes 1, 15. O significado de desamidação proteína, na verdade, ultrapassa o contexto bio...

Watch this Scientific Journal Video about LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics at JoVE.com

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

Aqui apresenta-se um protocolo passo-a-passo do método (LERLIC-MS / MS) de longa duração electrostática espectrometria de massa repulsão-hidrofílico interacção cromatografia em tandem. Esta é uma nova metodologia que permite pela primeira vez a quantificação e caracterização dos glutamina e asparagina isoformas de desamidação por proteómica espingarda.

LERLIC-MS / MS para Caracterização em profundidade e Quantificação de Glutamina e Asparagina em desamidação da espingarda Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Bioquímica

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Caracterização de Glicoproteínas com Dobra da Imunoglobulina por Cristalografia de Raios-X e Técnicas Biofísicas

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Tecnologia de Microarray da proteína extracelular para a deteção de alta taxa de transferência de interações ligante-Receptor de baixa afinidade

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Entidades vinculantes ao SUMO (SUBEs) como ferramentas para enriquecimento, isolamento, identificação e caracterização do Proteome SUMO em Câncer de Fígado

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Quantificação da coenzima A em células e tecidos

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Preparação da amostra TMT para envio de instalações proteômicas e análise de dados subsequentes

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

JUMPn: A Streamlined Application for Protein Co-Expression Clustering and Network Analysis in Proteomics

JUMPn: Uma aplicação simplificada para agrupamento de co-expressão de proteínas e análise de rede em proteômica

With recent advances in mass spectrometry-based proteomics technologies, deep profiling of hundreds of proteomes has become increasingly feasible. ...

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Processamento de amostras de proteômica de espingarda automatizada por um robô de laboratório de código aberto

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

Shotgun Lipidômica de Tecidos de Roedores

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have ...