Name: in ovo electroporation in the chicken auditory brainstem
Uploaded: 2017-06-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem at JoVE.com

ברצוננו להודות לד&quot;ר. Leslayann Schecterson, יואן ואנג, אנדרס Barria וגברת Ximena Optiz-Araya לסיוע ראשוני עם פרוטוקול הגדרת למתן פלסמידים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH / NIDCD מענק DC013841 (JTS).

כל הנהלים אושרו על ידי אוניברסיטת נורת &#39;ווסטרן טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדות, וביצעו בהתאם המוסדות הלאומיים לבריאות הנחיות לטיפול ושימוש של חיות מעבדה. 1. טיפול ביצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכ...

<ol>
	<li>Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sound+localization+in+mammals.">Mechanisms of sound localization in mammals.</a> Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).</li><li>Anderson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+timing+is+linked+to+speech+perception+in+noise.">Neural timing is linked to speech perception in noise.</a> J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).</li><li>Shannon, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speech+recognition+with+primarily+temporal+cues.">Speech recognition with primarily temporal cues.</a> Science. 270 (5234), 303-304 (1995).</li><li>Carr, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+development+of+time+coding+systems.">Evolution and development of time coding systems.</a> Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).</li><li>Carr, C. E., Soares, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+convergence+and+shared+computational+principles+in+the+auditory+system.">Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system.</a> Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).</li><li>Rubel, E. W., Parks, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken:+tonotopic+organization+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris.">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).</li><li>Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken:+ontogeny+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris.">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).</li><li>Schecterson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrkB+downregulation+is+required+for+dendrite+retraction+in+developing+neurons+of+chicken+nucleus+magnocellularis.">TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis.</a> J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).</li><li>Chesnutt, C., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-based+short-hairpin+RNA+interference+in+the+chicken+embryo.">Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo.</a> Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).</li><li>Oertel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+of+timing+in+the+brain+stem+auditory+nuclei+of+vertebrates.">Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates.</a> Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).</li><li>Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+auditory+brain-stem+nuclei+in+the+chick+hindbrain.">Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain.</a> Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).</li><li>Cramer, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+signaling+promotes+axon+segregation+in+the+developing+auditory+system.">EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system.</a> Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).</li><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies.">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. (8), e306 (2007).</li><li>Sanchez, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+culture+of+chicken+auditory+brainstem+slices.">Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li><li>Jhaveri, S., Morest, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+architecture+in+nucleus+magnocellularis+of+the+chicken+auditory+system+with+observations+on+nucleus+laminaris:+a+light+and+electron+microscope+study.">Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study.</a> Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).</li><li>Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+adeno-associated+virus+vector+efficiently+transduces+neurons+in+the+embryonic+and+post-embryonic+chicken+brain.">Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain.</a> PLoS One. 7 (11), e48730 (2012).</li><li>Koppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+nerve+terminals+in+the+cochlear+nucleus+magnocellularis:+differences+between+low+and+high+frequencies.">Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies.</a> J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).</li><li>Hyson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+interaural+time+differences+in+the+chick+brain+stem.">The analysis of interaural time differences in the chick brain stem.</a> Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).</li><li>Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+hearing+in+the+chicken+embryo.">Emergence of hearing in the chicken embryo.</a> J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).</li><li>Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+auditory+evoked+responses+in+the+cochlea+and+cochlear+nuclei+of+the+chick.">The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick.</a> Brain Res. 63, 59-74 (1973).</li><li>Woolf, N. K., Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+auditory+function+in+the+cochlea+of+the+mongolian+gerbil.">The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil.</a> Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).</li><li>Walsh, E. J., McGee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+development+of+auditory+nerve+and+cochlear+nucleus+neuronal+responses+in+kittens.">Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens.</a> Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).</li><li>Uziel, A., Romand, R., Marot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cochlear+potentials+in+rats.">Development of cochlear potentials in rats.</a> Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).</li></ol>

ב electroporation אובו היא שיטה להביע או להפיל גנים של עניין על מנת לנתח את תפקוד הגן vivo 8 , 9 . בעובר עוף, היא שיטה חדשנית להבעת גנים מקודדים פלסמיד לתוך אזורים שונים גזע המוח השמיעתי 8 . כדי להבטיח ביטוי אופטימלי, נדרש?...

קידוד עצבי מהיר של צליל הוא חיוני עבור פונקציות השמיעה נורמלי. אלה כוללים יכולות לוקליזציה צליל 1 , דיבור באפליה רעש 2 , ואת ההבנה של אותות תקשורת רלוונטיים אחרים רלוונטיים 3 . נוירונים אנלוגיים הממוקמים בגזע המוח השמיעתי של שני avians ו יונקים הם מאוד מיוחדים עבור קידוד עצבי מהיר 4 . אלה כוללים את גרעין העוף magnocellularis (NM), גרעין laminaris (NL) ואת האנלוגים יונקים שלהם, גרביים שבלול anteroventral (AVCN) ואת המדיום מעולה זית (MSO), בהתאמה. עם זאת, מנגנוני התפתחות המסדירים קידוד עצבי מהיר הם הבינו היטב את המוח השמיעתי. לכן, כדאי ללמוד גנים ספציפיים אשר אחראים על קידוד עצבי מהיר על מנת להבין טוב יותר את הביטוי, הרגולציה והפונקציה שלהם ב- auפיתוח דיטורי. העובר בפיתוח עוף הוא כלי מחקר יעיל ומבוסס ללמוד שאלות ביולוגיות בסיסיות של פיתוח מערכת השמיעה 6 , 7 . ההתקדמות המולקולרית האחרונות התייחסו לשאלות ביולוגיות אלה בעובר המתפתח על ידי הבעת או דפיקות גנים של עניין על מנת לנתח את תפקוד הגן vivo 8 , 9 . לחקור את התפקיד הרגולטורי של גנים ספציפיים היא התקדמות משמעותית בהבנת הפתולוגיות הקשורות גירעונות השמיעה. כאן, אנו מציגים electroporation אובו של גנים מקודדים פלסמיד לתוך המוח גזע עוף שמיעה שם קידוד עצבי מהיר של צליל מתרחשת 10 . על ידי מיקוד שמיעתי אזורים שמיעתי הקשורים rhombomeres 5 ו 6 11 , 12 (R5 /R6), אנו מראים שליטה מרחבית של transfection פלסמיד ב NM ו NL. בנוסף, אנו מראים הרגולציה הזמנית של הביטוי על ידי אימוץ טקט על וקטור המערכת. זהו הליך נוגד תרופה המבטא את הגנים של עניין בנוכחות doxycycline (Dox) 8 .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fertilized white leghorn chicken eggs</td>
			<td>Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>052-0500-900</td>
			<td>Picospritzer III, single or dual channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current/voltage stimulator</td>
			<td>Grass Technologies</td>
			<td>SD9</td>
			<td>SD9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfil syringe needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF28G67-5</td>
			<td>28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1280</td>
			<td>MP Series: Non-Electrical Pressure Applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulating microelectrode</td>
			<td>FHC</td>
			<td>PBSA1075</td>
			<td>PBSA1075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air tank/regulator</td>
			<td>NU Laboratory Services</td>
			<td></td>
			<td>Air dry 300 CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>F7258-25G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear plastic tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9891-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg refrigerator</td>
			<td>Vissani Wine Refrigerator</td>
			<td></td>
			<td>13.3-16.1&#176; C (56-61&#176; F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Hova-Bator</td>
			<td></td>
			<td>37.8&#176; C (100&#176; F), ~50% humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4.35E+15</td>
			<td>SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold-light source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4.36E+15</td>
			<td>CL6000 LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>Model: MM-3</td>
			<td>2 Micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-86-10</td>
			<td>Thick-walled borosilicate (dimensions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mL, 3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD Precision Glide&#160;</td>
			<td></td>
			<td>27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>No. 5 Super Fine Dumont</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg holder</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td></td>
			<td>Clay base works as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td>Model P-97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Ultra Cruz</td>
			<td>sc-358811</td>
			<td>PVDF 0.22 &#956;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in ovo electroporation in the chicken auditory brainstem

Electroporation היא שיטה המציגה גנים של עניין לתוך אורגניזמים ביולוגיים רלוונטיים כמו עוף העוף. זה כבר זמן רב כי העובר עוף הוא מודל מחקר יעיל לחקר תפקודים ביולוגיים בסיסיים של פיתוח מערכת השמיעה. לאחרונה, העובר עוף הפך חשוב במיוחד בחקר ביטוי גנים, רגולציה הפונקציה הקשורים השמיעה. ב electroporation אובו ניתן להשתמש כדי למקד אזורים המוח השמיעתי אחראי על פונקציות שמיעה מיוחדות מאוד. אזורים אלה כוללים את גרעין העוף magnocellularis (NM) ואת גרעין laminaris (NL). NM ו נוירונים NL נובעים מבשרי מובהק של rhombomeres 5 ו 6 (R5 / R6). כאן, אנו מציגים electroporation אובו של גנים מקודדים פלסמיד ללמוד מאפיינים הקשורים גנים באזורים אלה. אנו מראים שיטה לשליטה מרחבית וזמנית של ביטוי גנים המקדמים גם רווח או הפסד של פנוטיפ פונקציונליEs. על ידי מיקוד שמיעתי אזורים שמיעתי הקשורים R5 / R6, אנו מראים transfection פלסמיד ב NM ו NL. הרגולציה הזמנית של ביטוי גנים יכולה להיות מושגת על ידי אימוץ מערכת וקטורית. זהו הליך תרופתי מעורר אשר מבטא את הגנים של עניין בנוכחות doxycycline (Dox). ב ov electroporation טכניקה - יחד עם או ביוכימיים, פרמקולוגיים, או מבחני תפקודית vivo - מספק גישה חדשנית ללמוד פיתוח נוירון השמיעה תופעות פתופיזיולוגיות הקשורות.

אנו מראים כאן כי ב electroporation אובו מאפשר ביטוי גנים במערכת ביולוגית המתפתחת בדרך כלל. גנים מקודדים פלסמיד מוזרקים בפוקוס לתוך הצינור העצבי שמעל R5 / R6. דוגמה סכמטית של האלקטרודה ופיפטה מיקומים יחסית סמנים אנטומיים חשובים מוצג בתרשים 1A</stron...

Watch this Scientific Journal Video about In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem at JoVE.com

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

נוירונים גזעיים של גזע המוח של avians ויונקים הם מיוחדים עבור קידוד עצבי מהיר, תהליך בסיסי עבור פונקציות השמיעה הרגילה. נוירונים אלה נובעים מבשרי ברורים של המוח האחורי עובריים. אנו מציגים טכניקות ניצול electroporation להביע גנים במוח האחורי של עוברים עוף ללמוד תפקוד הגן במהלך פיתוח השמיעה.

ב Electrooration Ovo ב המוח עוף שמיעה

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

The overall goal of this procedure is to spatially and temporally control gene expression in the chicken auditory brainstem. The utilization of in ovo electroporation provides an innovative approach to study auditory neuron development and associated pathophysiological phenomena. This procedure can help you answer key questions in the field of auditory neural development, such as how does the control of gene expression promote either a gain or loss of phenotype that are required for normal auditory brainstem development.Demonstrating the procedure will be Doctor Ting Lu, a postdoctoral fellow from my laboratory. To begin, prepare plasmid solutions by adding one microliter of Fast Green solution for every seven microliters of DNA mixture. Next, mix DNA solutions at a one-to-one ratio for simultaneous electroporation of multiple plasmids.Once the plasmid solution is prepared, fabricate pipettes with a micropipette puller. Then use a 28-gauge syringe needle to fill the pipette with one to two microliters of the plasmid solution. Using forceps, break the pipette tip to 10 to 20 microns and determine the size of the broken tip under a microscope, then connect the pipette to a picospritzer via pipette holder.Prior to the procedure, store eggs purchased from a local vendor for no longer than five days in a refrigerator at 13 degrees Celsius. To begin, disinfect the egg with 70%ethanol, then to achieve proper embryo positioning, incubate the egg on its side at 38 degrees Celsius, and approximately 50%humidity to ensure optimal viability. After 48 to 52 hours of incubation, when the egg reaches Hamburger-Hamilton stage approximately 12 to 13, disinfect the work area and all instruments with 70%ethanol.Then remove the egg from the incubator, leave it at room temperature, and wipe it with 70%ethanol a second time. Using a light illuminator, identify the positioning of the embryo, visible as a dark area, and with a pencil, mark it by drawing a circle around its center. Poke a hold in the blunt end of the egg with a 19-gauge needle, then make a second hole near the drawn circle on the pointy end of the egg.Use the 19-gauge needle to remove a small piece of the outer eggshell, and with forceps, remove a small piece of the inner eggshell membrane. Next, introduce a 19-gauge needle attached to a three milliliter syringe through the hole at the blunt end of the egg, and withdraw 1.5 to 2.5 milliliters of albumin. Cover the hole at the blunt end of the egg with a one centimeter by one centimeter piece of tape, and then cover the drawn circle and the second hole with a 2.5 centimeter by four centimeter piece of tape.Using curved scissors with a cutting edge of 2.5 centimeters, and keeping them parallel to the eggshell, excise a window within the marked circle. To inject the plasmid, turn on the picospritzer and adjust the instrument's setting to apply pressure of 18 PSI for five microseconds, then turn on an air tank, and the lamp for the dissection microscope. Next, prepare 30 milliliters of a stock solution of the commercially purchased India Ink in sterile PBS.Aspirate the India Ink solution into a one milliliter syringe, then attach a 27-gauge needle and remove any bubbles that appear in the syringe. To visualize the embryo, introduce the needle just under the yolk membrane, approximately two to three millimeters from the embryo, and inject approximately 0.2 milliliters of India Ink. Then transfer the windowed egg to an egg holder, positioned under the dissection microscope, and switch to the highest magnification to achieve the best view of the plasmid injection site.Remove the membrane covering the injection area with forceps. Find the otocysts, and use them as landmarks to identify rhombomeres five and six, located nearby, from which nucleus magnocellularis and nucleus laminaris arise. Using a micromanipulator, position the pipette containing DNA in the neural tube that overlies the R5-R6 region in-between the otocysts.Eject DNA into the neural tube with the picospritzer. To begin electroporation, turn on the voltage stimulator, then attach a 0.22 micron syringe filter to a three milliliter syringe pre-filled with PBS, and add one to two drops of the filtered PBS onto the embryo. Subsequently, move a bipolar electrode toward the embryo using the micromanipulator, and position the negative electrode above the injection site, while maintaining the positive electrode lateral to the R5-R6.With the voltage stimulator, apply 20 pulses of 50 volts for one millisecond at one second intervals. You will see bubbles near the tip of the electrode. After electroporation, add one drop of PBS onto the exposed area, gently remove the electrode and clean it with a laboratory tissue and 70%ethanol, then cover the window over the embryo with tape.Finally, note the injected plasmid type, and the hatch date on the eggshell, and place the egg in the incubator with window-side facing up. Incubate the eggs at 38 degrees Celsius with 50%humidity, until desired developmental stage is reached. 24 hours after the electroporation, remove the egg from the incubator, open the window, and using a stereo microscope, confirm the correct location of the targeted plasmid injection.If tet-on vectors were used, pipette 50 microliters of Doxycycline into the chorioallantoic membrane, close the window, and put the egg back into the incubator. Presented here are photographs of a brainstem slice prepared from an embryonic day-12 chicken, taken under differential interference contrast illumination and fluorescent illumination. The nucleus magnocellularis and nucleus laminaris can be recognized within the brainstem slice.Under fluorescent illumination, both structures reveal the expression of yellow fluorescent protein, confirming efficient spatial expression of the electroporated genes. The expression of the electroporated gene can be also observed in a brainstem slice comprising the nucleus magnocellularis obtained from an embryonic day-18 chicken. When magnified 80 times, the classic adendritic cell bodies are visible under differential interference contrast illumination.Adendritic cell bodies reveal yellow fluorescent protein expression, further demonstrating that in ovo electroporation can induce gene expression in specific auditory brainstem regions for studies on auditory neuron development. Once mastered, and if it is performed properly, this technique can be done in two to three hours for approximately 12 viable eggs. Following this procedure, other methods like biochemical, pharmacological, and in vitro-in vivo functional assays can be performed in order to answer additional questions about how gene expression phenotypes regulate normal auditory brainstem development.After watching this video, you should have a good understanding of how to spatially and temporally control gene expression in the chicken auditory brainstem. In ovo electroporation permits genetic control of anatomical and physiological specializations, and well-defined time periods in auditory brainstem development.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

העברה יעילה ג&#39;ין בצ&#39;יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות:<em&gt; אקס-אוב</em&gt; גישת Electroporation

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Explants רשתית שלם מעוף עוברים לטיפולי Electroporation וכימיים מגיב

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי<em&gt; ב אובו</em&gt; מיקרו electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

רומן<em&gt; אקס אובו</em&gt; טכניקת פסים לאלטר ופרמטרים המודינמיים intracardiac במערכת עוף עוברי

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

העובר Microinjection ו Electroporation ב chordate<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Organotypic תלת מימדי התרבויות שיווי המשקל ושמיעתיים אברי החישה

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...