Name: visualization and quantitative analysis of embryonic angiogenesis in xenopus tropicalis
Uploaded: 2017-05-25T14:00:00
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Diese Studie wurde von der Arbeit von Levine et al. , Die diese experimentelle Methode beschrieben und eine umfassende Beschreibung der vaskulären Entwicklung in Xenopus laevis zur Verfügung stellte . Wir danken den Mitgliedern unseres Labors für ihre Inputs. Diese Studie wurde von der Yonsei University Future-führenden Forschungsinitiative von 2015 (2015-22-0095) und dem Bio &amp; Medical Technology Development Program der Nationalen Forschungsstiftung (NRF) unterstützt, die vom Ministerium für Wissenschaft, IKT &amp; Zukunftsplanung ( NRF-2013M3A9D5072551)

Alle Experimente erfüllten die Protokolle, die von der Yonsei University College of Medicine Institutional Animal Care und Use Committees genehmigt wurden. 1. Vorbereitung von Xenopus tropicalis Embryos ANMERKUNG : Xenopus tropicalis Embryos wurden wie zuvor beschrieben 10 mit leichter Modifikation hergestellt. Xenopus tropicalis Embryos wurden nach den Tabellen von Nieuwkoop und Faber 11 inszeniert. <...

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	<li>Herbert, S. P., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+endothelial+cell+behaviour+during+blood+vessel+morphogenesis.">Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).</li><li>Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+vascular+morphogenesis+and+homeostasis+through+the+angiopoietin-Tie+system.">Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteries+and+veins:+making+a+difference+with+zebrafish.">Arteries and veins: making a difference with zebrafish.</a> Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).</li><li>Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+endothelial+cells+allows+in+vivo,+continuous+characterization+of+the+vascular+development+of+Xenopus+laevis.">Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis.</a> Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).</li><li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+Mediates+Ca2+-Dependent+Inhibition+of+Tie2+Signaling+and+Acts+as+a+Developmental+Brake+During+Embryonic+Angiogenesis.">Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell-stage+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo.</a> Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).</li><li>Elliott, K. L., Houston, D. W., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Xenopus+laevis+tissues+to+determine+the+ability+of+motor+neurons+to+acquire+a+novel+target.">Transplantation of Xenopus laevis tissues to determine the ability of motor neurons to acquire a novel target.</a> PLoS One. 8 (2), 55541 (2013).</li><li>Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tropicalis+as+a+model+organism+for+genetics+and+genomics:+past,+present,+and+future.">Xenopus tropicalis as a model organism for genetics and genomics: past, present, and future.</a> Methods Mol Biol. 917, 3-15 (2012).</li><li>Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+lysine+residues+of+plasma+lipoproteins+in+high+affinity+binding+to+cell+surface+receptors+on+human+fibroblasts.">Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts.</a> J Biol Chem. 253 (24), 9053-9062 (1978).</li><li>Showell, C., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+collection+and+in+vitro+fertilization+of+the+western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis.">Egg collection and in vitro fertilization of the western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (9), 5293 (2009).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).</li><li>Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Neurite+Tracer:+open+source+software+for+reconstruction,+visualization+and+analysis+of+neuronal+processes.">Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes.</a> Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).</li><li>Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+TrkB+signaling+in+presynaptic+retinal+ganglion+cells+mediates+axon+arbor+growth+and+synapse+maturation+during+the+establishment+of+retinotectal+synaptic+connectivity.">Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity.</a> J Neurosci. 27 (10), 2444-2456 (2007).</li><li>Cha, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionarily+repurposed+networks+reveal+the+well-known+antifungal+drug+thiabendazole+to+be+a+novel+vascular+disrupting+agent.">Evolutionarily repurposed networks reveal the well-known antifungal drug thiabendazole to be a novel vascular disrupting agent.</a> PLoS Biol. 10 (8), 1001379 (2012).</li><li>Ny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+Xenopus+laevis+reporter+model+to+study+lymphangiogenesis.">A transgenic Xenopus laevis reporter model to study lymphangiogenesis.</a> Biol Open. 2 (9), 882-890 (2013).</li><li>Bussmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteries+provide+essential+guidance+cues+for+lymphatic+endothelial+cells+in+the+zebrafish+trunk.">Arteries provide essential guidance cues for lymphatic endothelial cells in the zebrafish trunk.</a> Development. 137 (16), 2653-2657 (2010).</li><li>Li, X. M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+acetylated+low-density+lipoprotein+uptake+and+low+tyrosine+kinase+with+immunoglobulin+and+epidermal+growth+factor+homology+domains-2+(Tie2)+promoter+activity+distinguish+sinusoids+from+other+vessel+types+in+murine+bone+marrow.">High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow.</a> Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).</li></ol>

Das hier vorgestellte Protokoll wurde zuerst von Ali H. Brivanlou und Kollegen entwickelt, um Entwicklungsereignisse während der Gefäßbildung in Xenopus laevis 4 zu untersuchen, aber wie in diesem Manuskript gezeigt, kann es auf andere kleine Tiere angewendet werden. Die Farbinjektion in das Herz ist einfach durchzuführen, und das gesamte Gefäßnetzwerk kann unter einem Fluoreszenzdissektionsmikroskop sowie ein konfokales Mikroskop abgebildet werden. Wenn der Farbstoff während der ...

Die Vaskulogenese, die Bildung neuer Blutgefäße aus neugeborenen Endothelzellen und die Angiogenese, die Bildung neuer Gefäße aus bereits vorhandenen Gefäßen, sind zwei verschiedene Prozesse, die das embryonale Gefäßbild verändern. Jede Dysregulation in diesen Prozessen führt zu verschiedenen Herzerkrankungen und strukturellen Anomalien der Gefäße. Darüber hinaus ist das Tumorwachstum mit dem unkontrollierten Gefäßwachstum verbunden. Als solche sind molekulare Mechanismen, die der Vaskulogenese und der Angiogenese zugrunde liegen, Gegenstand intensiver Untersuchungen 2 . Xenopus und Zebrafisch sind aus verschiedenen Gründen attraktive Wirbeltiermodelle für Vaskulogenese- und Angiogenese-Studien. Zuerst sind ihre Embryos klein; Daher ist es relativ einfach, die gesamte vaskulatur zu bildlich zu machen. Zweitens ist die embryonale Entwicklung schnell; Es dauert nur ein paar tage für das gesamte vasculature zu entwickeln, während welcher zeit das entwickelnde vaskul<html> Ature kann abgebildet werden. Drittens sind genetische und pharmakologische Interventionen vor und während der Gefäßbildung leicht durchzuführen, wie durch die Mikroinjektion von Antisense-Morpholino-Nukleotiden (MOs) in den sich entwickelnden Embryo oder durch die Badanwendung der Medikamente 3 , 4 , 5 . Der einmalige Vorteil von Xenopus über Zebrafisch ist, dass embryologische Manipulationen durchgeführt werden können, weil Xenopus stereotypen holoblastischen Spaltungen folgt und die embryonale Schicksalskarte gut definiert ist 6 . Beispielsweise ist es möglich, einen Embryo zu erzeugen, bei dem nur eine laterale Seite genetisch manipuliert wird, indem man ein Antisense-MO zu einer Zelle im Zweizellenstadium injiziert. Es ist auch möglich, das Herz-Primordium von einem Embryo zu einem anderen zu transplantieren, um zu bestimmen, ob das Gen seine Funktion durch einen zell-intrinsischen oder -extrinsischen Mechanismus ausübtAss = &quot;xref&quot;&gt; 7 Obwohl diese Techniken meist in Xenopus laevis entwickelt wurden, das allotetraploid ist und daher nicht ideal für genetische Studien ist, können sie direkt auf Xenopus tropicalis angewendet werden , eine eng verwandte diploide Spezies 8 . Eine Möglichkeit, die Vaskulatur in einem lebenden Xenopus- Embryo zu visualisieren, besteht darin, einen Fluoreszenzfarbstoff zu injizieren, um die Blutgefäße zu etikettieren. Acetyliertes Lipoprotein mit niedriger Dichte (AcLDL), das mit einem fluoreszierenden Molekül wie DiI markiert ist, ist eine sehr nützliche Sonde. Im Gegensatz zu nichtacetyliertem LDL bindet AcLDL nicht an den LDL-Rezeptor 9, sondern wird durch Makrophagen und Endothelzellen endozytiert. Die Injektion von DiI-AcLDL in das Herz eines lebenden Tieres führt zu einer spezifischen fluoreszierenden Markierung von Endothelzellen, und das gesamte Gefäßsystem kann durch Fluoreszenzmikroskopie in lebenden oder fixierten Embryonen abgebildet werden 4 . Hier haben wir vorDetaillierte Protokolle für die Visualisierung und Quantifizierung von Blutgefäßen mit DiI-AcLDL in Xenopus tropicalis ( Abbildung 1 ). Wir bieten wichtige praktische Punkte, mit Beispielen für erfolgreiche und erfolglose Experimente. Darüber hinaus bieten wir eine einfache Methode zur quantitativen Analyse der vaskulären Komplexität, die bei der Beurteilung der Auswirkungen von genetischen und umweltbedingten Faktoren auf die Formgebung des Gefäßnetzes nützlich sein könnte.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="539">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">35mm Petri dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">10035</td>
			<td style="width:180px;">Sylgard mold frame</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">60mm Petri dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">10060</td>
			<td>Embryo raising tray</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Borosilicate Glass</td>
			<td style="width:113px;">Sutter instrument</td>
			<td style="width:93px;">B100-50-10</td>
			<td>Needle for injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">BSA</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">A3059-10G</td>
			<td>Coating reagent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">CaCl2</td>
			<td style="width:113px;">D.S.P.GR Reagent</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>0.1X MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Coverslip</td>
			<td style="width:113px;">Superior</td>
			<td style="width:93px;">HSU-0111520</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">DiI-AcLDL</td>
			<td style="width:113px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:93px;">L3484</td>
			<td>Vessel staining solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">FBS</td>
			<td style="width:113px;">Hyclone</td>
			<td style="width:93px;">SH.30919.02</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Fiber Optical Illuminator</td>
			<td style="width:113px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:93px;">Z-LITE-Z</td>
			<td>Light</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Ficoll</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">F4375</td>
			<td>Injection buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:113px;">Sutter instrument</td>
			<td style="width:93px;">P-97</td>
			<td>Injection needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Forcep</td>
			<td style="width:113px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:93px;">11255-20</td>
			<td style="width:180px;">For embryo hatching and 
			needle tip cutting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Glass Bottom dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">100350</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">hCG</td>
			<td style="width:113px;">MNS Korea</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>For priming of frogs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">HEPES</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">H3375</td>
			<td>Buffering agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Incubator</td>
			<td style="width:113px;">Lab. Companion</td>
			<td style="width:93px;">ILP-02</td>
			<td>For raising embryos</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">KCl</td>
			<td style="width:113px;">DAEJUNG</td>
			<td style="width:93px;">6566-4400</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">L15 medium</td>
			<td style="width:113px;">Gibco</td>
			<td style="width:93px;">11415-114</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">L-cysteine</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">168149-100G</td>
			<td>De-jellying reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">MgSO4</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">M7506</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Microtube</td>
			<td style="width:113px;">Axygen</td>
			<td style="width:93px;">MCT-175-C-S</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">MS222</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">E10521</td>
			<td>Anesthetic powder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">NaCl</td>
			<td style="width:113px;">DAEJUNG</td>
			<td style="width:93px;">7647-14-5</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">NaOH</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">S-0899</td>
			<td>pH adjusting reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P6148</td>
			<td>Fixatives</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">PBS</td>
			<td style="width:113px;">BIOSESANG</td>
			<td style="width:93px;">P2007</td>
			<td>Buffer for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">pH paper</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P4536-100EA</td>
			<td>For confirming pH</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">PICO-LITER INJECTOR</td>
			<td style="width:113px;">Waner instruments</td>
			<td style="width:93px;">PLI-100A</td>
			<td>For injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Pin</td>
			<td style="width:113px;">Pinservice</td>
			<td style="width:93px;">26002-10</td>
			<td>For incision</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Pinholder</td>
			<td style="width:113px;">Scitech Korea</td>
			<td style="width:93px;">26016-12</td>
			<td>For incision</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Precision Stereo Zoom Binocular Microscope</td>
			<td style="width:113px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:93px;">PZMIII</td>
			<td>For visual screening</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:153px;">Standard Manual Control Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Waner instruments</td>
			<td style="width:93px;">W4 64-0056</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">SYLGARD 184 Kit</td>
			<td style="width:113px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>For DiI injection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Transfer pipette</td>
			<td style="width:113px;">Korea Ace Scientific Co.</td>
			<td style="width:93px;">YM.B78-400</td>
			<td>For eggs and 
			embryo collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantitative analysis of embryonic angiogenesis in xenopus tropicalis

Blutgefäße liefern Sauerstoff und Nährstoffe im ganzen Körper, und die Bildung des Gefäßnetzes ist unter engen Entwicklungskontrolle. Die effiziente In-vivo- Visualisierung von Blutgefäßen und die zuverlässige Quantifizierung ihrer Komplexität sind der Schlüssel zum Verständnis der Biologie und der Erkrankung des Gefäßnetzes. Hier stellen wir eine detaillierte Methode zur Verfügung, um Blutgefäße mit einem handelsüblichen Fluoreszenzfarbstoff, einem humanen Plasma acetylierten Diiplex (DiI-AcLDL) mit niedriger Dichte zu identifizieren und ihre Komplexität in Xenopus tropicalis zu quantifizieren . Blutgefäße können durch eine einfache Injektion von DiI-AcLDL in das schlagende Herz eines Embryos markiert werden, und Blutgefäße im gesamten Embryo können in lebenden oder fixierten Embryonen abgebildet werden. Kombiniert mit der Genstörung durch die gezielte Mikroinjektion von Nukleinsäuren und / oder die Badanwendung von pharmakologischen Reagenzien können die Rollen eines Gens oder eines Signalweges auf der Gefäßentwicklung auftretenStammte innerhalb einer Woche ohne Rückgriff auf anspruchsvolle gentechnisch veränderte Tiere. Wegen des wohldefinierten venösen Systems von Xenopus und seiner stereotypen Angiogenese kann das Keimen von bereits vorhandenen Gefäßen die Gefäßkomplexität nach Störungsexperimenten effizient quantifiziert werden. Dieses relativ einfache Protokoll sollte als ein leicht zugängliches Werkzeug in verschiedenen Bereichen der Herz-Kreislauf-Forschung dienen.

Zeitplan der Experimente (Abb. 1 und 2) Kurz nach der Befruchtung kann eine gezielte Mikroinjektion durchgeführt werden, um die Genexpression zu modulieren. Beispielsweise kann ein Antisense-MO, das spezifisch an das Initiationscodon der endogenen Tie2-mRNA bindet, injiziert werden, was die Translation von Tie2-Ziel-mRNA durch sterische Hinderung hemmt. Ein MO kann mit Fluorescein für die einfache visuelle Screening von erfolgr...

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Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Dieses Protokoll zeigt eine fluoreszenzbasierte Methode zur Visualisierung der Vaskulatur und zur Quantifizierung ihrer Komplexität in Xenopus tropicalis . Blutgefäße können nach der Injektion eines fluoreszierenden Farbstoffs in das schlagende Herz eines Embryos nach genetischen und / oder pharmakologischen Manipulationen abgebildet werden, um die kardiovaskuläre Entwicklung in vivo zu untersuchen.

Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

The overall goal of this procedure is to visualize the vasculature of Xenopus tropicalis tadpoles. This method can help answer key questions in the field of cardiovascular biology such as how angiogenesis is regulated. The main advantage of this technique is that blood vessels in an intact well type embryo can be visualized by a simple fluorescent dye injection.Begin by using a micro loader to fill a tapered glass micro pipette with approximately five microliters of clear diI acetylated LDL solution taking care that no precipitated particles are loaded. Under a dissecting microscope use a fine pair of number 55 forceps to clip the tip of the pipette to adjust the volume of the uploaded complex and set the pressure controlled injection system to eject approximately five nano liters of solution per injection. Then submerge the pipette tip in 0.04%MS-222 in 0.1X modified Barth's saline or MBS in a custom made Sylgard mold.Next transfer Xenopus tropicalis embryo to the Sylgard mold and confirm complete sedation with a lack of response to dorsal fin stimulation. Under the dissecting microscope load the embryo ventral side up into the V shaped indentation of the mold in a slightly oblique position. Tightly fit two 0.1 millimeter minutian pins to a pin holder and use one pin to puncture the skin over the heart which should be visibly pulsing.Insert the pin through the hole in the space between the heart and the skin without puncturing the heart and position the inserted tip within the region where the incision will be made. Then rub the second pin against the inserted pin to make a linear incision and use both pins together to gently widen the incision, exposing the heart. To inject the DiI acetylated LDL solution, insert the glass pipette tip into the heart and inject 50 to 60 nano liters of the DiI acetylated LDL in approximately 10 ejection pulses.When all of the dye solution has been delivered confirm that the heart is still beating and transfer the embryo into a new Petri dish containing 0.1X MBS. After five to 10 minutes the tadpole should recover from anesthesia and begin to move. After an appropriate number of embryos have been injected, visually screen the correctly labeled anesthetized embryos under a fluorescence microscope discarding any animals that have other organs labeled.Embryos that have been insufficiently labeled can be injected again. Then capture images of the correctly labeled embryos. For a more thorough imaging of the blood vessels, fix re anesthetized embryos in 4%paraformaldehyde for one hour at room temperature protected from light for visualization by confocal microscopy.If a sufficient amount of diI acetylated LDL is injected into the heart, the posterior cardinal vein, or PCV, should be immediately visible under a fluorescence microscope. The intersomitic veins, or ISV's, emerge dorsally from the PCV in an anterior to posterior wave beginning at stage 36 and ending around stage 40 to 41 becoming lightly branched around stage 43. The PCV and ISV's grow in a stereotypical angiogenic pattern that is under tight developmental control.Interestingly, the knockdown of TIE-2 signaling by antisense morphalinos decreases the length and the complexity of the ISV's whereas expression of the constitutively active form of TIE-2 induces excessive ISV branching. A Vein Complexity Index can be calculated to assess the complexity of the ISV's and rendered paths can be generated to visualize the overall architecture of the embryonic Xenopus tropicalis vasculature. The original protocol was described for using Xenopus laevis by Levin and Colics and we adapted it for Xenopus tropicalis.Once mastered, this technique can be completed in one hour if it is performed properly. Before this procedure, genetic and pharmacological manipulations can be performed to answer additional questions such as which genes and signaling pathways regulate vascular development. Using this procedure the labeled vasculature can be imaged in an intact animal in real time providing a powerful tool for investigating the dynamics of vascular development.After watching this video you should have a good understanding of how to inject diI acetylated LDL into the heart of a Xenopus tropicalis tadpole to visualize it's vasculature.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ausbau der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eizellen, von Intrazytoplasmatische Spermieninjektion gefolgt, um embryonale Entwicklungsstudie

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse Cardiomyocyte Entwicklung mit Immunfluoreszenz in embryonalen Maus Herz

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualisierung von Chondrozyten-Einlagerung und Directional Verbreitung über Zebrabow klonalen Zellanalyse in der embryonalen Meckel-Knorpel

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stammzell-ähnlichen<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantate bis Früh Neurale Entwicklungs- Eigenschaften Studieren<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In-vivo-</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transkriptom Profilieren<em&gt; In-Vivo</em&gt; Produziert Bovine Präimplantationsembryonen Mit Zwei-Farben-Microarray-Plattform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technik auf Zielmikroinjektions an die Entwicklungs<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Die Analyse der Herzkranzgefäße in Gelöscht Embryonale Herz

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Lichtvermittelte reversible Modulation des mitogenaktivierten Proteinkinase-Pathways während der Zelldifferenzierung und<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Entwicklung

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...