Name: visualization and quantitative analysis of embryonic angiogenesis in xenopus tropicalis
Uploaded: 2017-05-25T14:00:00
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この研究は、 Levine et al。これは、この実験方法を記載し、 アフリカツメガエルの血管発生の包括的な説明を提供した。私たちは研究室のメンバーに感謝の意を表します。この研究は、2015年（2015-22- 0095）の将来的な研究イニシアチブと科学、ICT＆未来計画の資金提供を受けて国立研究財団（NRF）のバイオ＆医療技術開発プログラムNRF-2013M3A9D5072551）

すべての実験は、延世大学医学系機関の動物用ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコールを遵守した。 1. ツメガエルトロピカリス胚の調製 注： アフリカツメガエルトロピカリス胚は、わずかに改変して、以前に記載されたようにして産生された。 Xenopus tropicalisの胚は、NieuwkoopおよびFaber 11の表に従って飼育...

<ol>
	<li>Herbert, S. P., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+endothelial+cell+behaviour+during+blood+vessel+morphogenesis.">Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).</li><li>Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+vascular+morphogenesis+and+homeostasis+through+the+angiopoietin-Tie+system.">Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteries+and+veins:+making+a+difference+with+zebrafish.">Arteries and veins: making a difference with zebrafish.</a> Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).</li><li>Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+endothelial+cells+allows+in+vivo,+continuous+characterization+of+the+vascular+development+of+Xenopus+laevis.">Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis.</a> Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).</li><li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+Mediates+Ca2+-Dependent+Inhibition+of+Tie2+Signaling+and+Acts+as+a+Developmental+Brake+During+Embryonic+Angiogenesis.">Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell-stage+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo.</a> Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).</li><li>Elliott, K. L., Houston, D. W., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Xenopus+laevis+tissues+to+determine+the+ability+of+motor+neurons+to+acquire+a+novel+target.">Transplantation of Xenopus laevis tissues to determine the ability of motor neurons to acquire a novel target.</a> PLoS One. 8 (2), 55541 (2013).</li><li>Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tropicalis+as+a+model+organism+for+genetics+and+genomics:+past,+present,+and+future.">Xenopus tropicalis as a model organism for genetics and genomics: past, present, and future.</a> Methods Mol Biol. 917, 3-15 (2012).</li><li>Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+lysine+residues+of+plasma+lipoproteins+in+high+affinity+binding+to+cell+surface+receptors+on+human+fibroblasts.">Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts.</a> J Biol Chem. 253 (24), 9053-9062 (1978).</li><li>Showell, C., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+collection+and+in+vitro+fertilization+of+the+western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis.">Egg collection and in vitro fertilization of the western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (9), 5293 (2009).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).</li><li>Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Neurite+Tracer:+open+source+software+for+reconstruction,+visualization+and+analysis+of+neuronal+processes.">Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes.</a> Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).</li><li>Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+TrkB+signaling+in+presynaptic+retinal+ganglion+cells+mediates+axon+arbor+growth+and+synapse+maturation+during+the+establishment+of+retinotectal+synaptic+connectivity.">Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity.</a> J Neurosci. 27 (10), 2444-2456 (2007).</li><li>Cha, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionarily+repurposed+networks+reveal+the+well-known+antifungal+drug+thiabendazole+to+be+a+novel+vascular+disrupting+agent.">Evolutionarily repurposed networks reveal the well-known antifungal drug thiabendazole to be a novel vascular disrupting agent.</a> PLoS Biol. 10 (8), 1001379 (2012).</li><li>Ny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+Xenopus+laevis+reporter+model+to+study+lymphangiogenesis.">A transgenic Xenopus laevis reporter model to study lymphangiogenesis.</a> Biol Open. 2 (9), 882-890 (2013).</li><li>Bussmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteries+provide+essential+guidance+cues+for+lymphatic+endothelial+cells+in+the+zebrafish+trunk.">Arteries provide essential guidance cues for lymphatic endothelial cells in the zebrafish trunk.</a> Development. 137 (16), 2653-2657 (2010).</li><li>Li, X. M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+acetylated+low-density+lipoprotein+uptake+and+low+tyrosine+kinase+with+immunoglobulin+and+epidermal+growth+factor+homology+domains-2+(Tie2)+promoter+activity+distinguish+sinusoids+from+other+vessel+types+in+murine+bone+marrow.">High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow.</a> Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).</li></ol>

ここに提示されたプロトコールは、 Xenopus laevis 4における血管形成中の発生事象を調査するためにAli H. Brivanlouらによって最初に開発されたが、この原稿に示されているように、他の小動物にも適用できる。心臓への色素注入は実行するのが簡単であり、血管ネットワーク全体を共焦点顕微鏡と同様に蛍光解剖顕微鏡下で画像化することができる。血管の発達中に色素?...

脈管形成、新しく生まれた内皮細胞からの新しい血管の形成、および血管新生（既存の血管か​​らの新しい血管の形成）は、胚性血管系を形成する2つの異なるプロセスである。これらのプロセスにおける調節不全は、様々な心疾患および血管の構造異常をもたらす。さらに、腫瘍の増殖は、制御されていない血管の成長と関連している。このように、脈管形成および血管新生の根底にある分子メカニズムは、激しい研究2の対象である。 アフリカツメガエルおよびゼブラフィッシュは、いくつかの理由から、脈管形成および血管形成研究のための魅力的な脊椎動物モデルである。まず、彼らの胚は小さいです。したがって、脈管構造全体を画像化することは比較的容易である。第二に、胚発生は急速である。脈管構造全体が発達するには数日しかかかりませんが、その間に発達中の血管<html>画像を撮影することができる。第3に、血管形成の前および間における遺伝子および薬理学的介入は、アンチセンスモルホリノヌクレオチド（MO）の発達中の胚へのマイクロインジェクションまたは薬物3、4,5の浴適用などの実施が容易である。 ゼブラフィッシュに対するXenopusのユニークな利点は、 アフリカツメガエルがステレオタイプの巨胞性切断に続き、胚の運命マップが明確に定義されているため、発生学的操作を行うことができることです。例えば、アンチセンスMOを2細胞段階で1つの細胞に注入することによって、1つの側面のみが遺伝子操作される胚を作製することが可能である。心臓原基をある胚から別の胚へ移植することも可能であり、遺伝子が細胞内因性または胸腺内機構によってその機能を発揮するかどうかを決定することが可能であるass = &quot;xref&quot;&gt; 7。これらの技術は、ほとんどがアロトプラドイドであり、したがって遺伝学的研究には理想的ではないアフリカツメガエル（Xenopus laevis）で開発されてきたが、密接に関連する二倍体種であるアフリカツメガエル熱帯魚に直接適用することができる8 。 生きているアフリカツメガエル胚の脈管構造を可視化する1つの方法は、血管に標識するために蛍光色素を注入することである。 DiIのような蛍光分子で標識したアセチル化低密度リポタンパク質（AcLDL）は非常に有用なプローブである。非アセチル化LDLとは異なり、AcLDLはLDL受容体9に結合しないが、マクロファージおよび内皮細胞によってエンドサイトーシスされる。生きている動物の心臓にDiI-AcLDLを注入すると、内皮細胞の特異的な蛍光標識が得られ、脈管構造全体を生きている胚または固定された胚の蛍光顕微鏡で画像化することができる4 。 ここでは、Xenopus tropicalisの DiI-AcLDLを用いた血管の可視化と定量の詳細なプロトコール（ 図1 ）。成功した実験と成功しなかった実験の例を中心に実践的なポイントを提供します。さらに、我々は、血管網の形成に及ぼす遺伝的および環境的要因の影響を評価するのに有用であり得る、血管複雑性の定量分析のための直接的な方法を提供する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="539">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">35mm Petri dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">10035</td>
			<td style="width:180px;">Sylgard mold frame</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">60mm Petri dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">10060</td>
			<td>Embryo raising tray</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Borosilicate Glass</td>
			<td style="width:113px;">Sutter instrument</td>
			<td style="width:93px;">B100-50-10</td>
			<td>Needle for injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">BSA</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">A3059-10G</td>
			<td>Coating reagent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">CaCl2</td>
			<td style="width:113px;">D.S.P.GR Reagent</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>0.1X MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Coverslip</td>
			<td style="width:113px;">Superior</td>
			<td style="width:93px;">HSU-0111520</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">DiI-AcLDL</td>
			<td style="width:113px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:93px;">L3484</td>
			<td>Vessel staining solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">FBS</td>
			<td style="width:113px;">Hyclone</td>
			<td style="width:93px;">SH.30919.02</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Fiber Optical Illuminator</td>
			<td style="width:113px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:93px;">Z-LITE-Z</td>
			<td>Light</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Ficoll</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">F4375</td>
			<td>Injection buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:113px;">Sutter instrument</td>
			<td style="width:93px;">P-97</td>
			<td>Injection needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Forcep</td>
			<td style="width:113px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:93px;">11255-20</td>
			<td style="width:180px;">For embryo hatching and 
			needle tip cutting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Glass Bottom dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">100350</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">hCG</td>
			<td style="width:113px;">MNS Korea</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>For priming of frogs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">HEPES</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">H3375</td>
			<td>Buffering agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Incubator</td>
			<td style="width:113px;">Lab. Companion</td>
			<td style="width:93px;">ILP-02</td>
			<td>For raising embryos</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">KCl</td>
			<td style="width:113px;">DAEJUNG</td>
			<td style="width:93px;">6566-4400</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">L15 medium</td>
			<td style="width:113px;">Gibco</td>
			<td style="width:93px;">11415-114</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">L-cysteine</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">168149-100G</td>
			<td>De-jellying reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">MgSO4</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">M7506</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Microtube</td>
			<td style="width:113px;">Axygen</td>
			<td style="width:93px;">MCT-175-C-S</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">MS222</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">E10521</td>
			<td>Anesthetic powder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">NaCl</td>
			<td style="width:113px;">DAEJUNG</td>
			<td style="width:93px;">7647-14-5</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">NaOH</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">S-0899</td>
			<td>pH adjusting reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P6148</td>
			<td>Fixatives</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">PBS</td>
			<td style="width:113px;">BIOSESANG</td>
			<td style="width:93px;">P2007</td>
			<td>Buffer for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">pH paper</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P4536-100EA</td>
			<td>For confirming pH</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">PICO-LITER INJECTOR</td>
			<td style="width:113px;">Waner instruments</td>
			<td style="width:93px;">PLI-100A</td>
			<td>For injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Pin</td>
			<td style="width:113px;">Pinservice</td>
			<td style="width:93px;">26002-10</td>
			<td>For incision</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Pinholder</td>
			<td style="width:113px;">Scitech Korea</td>
			<td style="width:93px;">26016-12</td>
			<td>For incision</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Precision Stereo Zoom Binocular Microscope</td>
			<td style="width:113px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:93px;">PZMIII</td>
			<td>For visual screening</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:153px;">Standard Manual Control Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Waner instruments</td>
			<td style="width:93px;">W4 64-0056</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">SYLGARD 184 Kit</td>
			<td style="width:113px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>For DiI injection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Transfer pipette</td>
			<td style="width:113px;">Korea Ace Scientific Co.</td>
			<td style="width:93px;">YM.B78-400</td>
			<td>For eggs and 
			embryo collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantitative analysis of embryonic angiogenesis in xenopus tropicalis

血管は酸素と栄養を体全体に供給し、脈管網の形成は緊密な発生制御下にある。血管の効率的なインビボ視覚化およびそれらの複雑さの確実な定量化は、血管ネットワークの生物学および疾患を理解する上で重要である。ここでは、市販の蛍光色素、ヒト血漿アセチル化低密度リポタンパク質DiI複合体（DiI-AcLDL）を用いて血管を可視化し、 アフリカツメガエルのトロピカリスにおける複雑性を定量化する詳細な方法を提供する。血管は、DiI-AcLDLを拍動する胚の心臓に簡単に注入することによって標識することができ、胚全体の血管を生きている胚または固定された胚に画像化することができる。核酸の標的とされたマイクロインジェクションによる遺伝子摂動および/または薬理学的試薬のバス適用と組み合わせて、血管発生における遺伝子またはシグナル伝達経路の役割は、洗練された遺伝子組み換え動物に頼らずに1週間以内に徴候を起こしました。 Xenopusの明確な静脈系およびその定型血管形成、既存の血管の発芽のために、血管の複雑さは、摂動実験後に効率的に定量化することができる。この比較的簡単なプロトコールは、心臓血管研究の様々な分野において容易にアクセス可能なツールとして役立つはずである。

実験のタイムライン（図1および2） 受精直後に、遺伝子発現を調節するために標的化されたマイクロインジェクションを行うことができる。例えば、内在性Tie2 mRNAの開始コドンに特異的に結合するアンチセンスMOを注入することができ、立体障害によるTie2標的mRNAの翻訳を阻害する。 MOは、うまく注入された胚の容易な視覚?...

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Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

このプロトコルは、脈管構造を視覚化し、 Xenopus tropicalisにおけるその複雑性を定量化する蛍光ベースの方法を実証する。インビボでの心臓血管発達を研究するために、遺伝的および/または薬理学的操作の後、胚の拍動する心臓に蛍光色素を注入した後、数分後に血管を撮像することができる。

の胚性血管新生の可視化と定量分析<em&gt;ツメガエル</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

The overall goal of this procedure is to visualize the vasculature of Xenopus tropicalis tadpoles. This method can help answer key questions in the field of cardiovascular biology such as how angiogenesis is regulated. The main advantage of this technique is that blood vessels in an intact well type embryo can be visualized by a simple fluorescent dye injection.Begin by using a micro loader to fill a tapered glass micro pipette with approximately five microliters of clear diI acetylated LDL solution taking care that no precipitated particles are loaded. Under a dissecting microscope use a fine pair of number 55 forceps to clip the tip of the pipette to adjust the volume of the uploaded complex and set the pressure controlled injection system to eject approximately five nano liters of solution per injection. Then submerge the pipette tip in 0.04%MS-222 in 0.1X modified Barth's saline or MBS in a custom made Sylgard mold.Next transfer Xenopus tropicalis embryo to the Sylgard mold and confirm complete sedation with a lack of response to dorsal fin stimulation. Under the dissecting microscope load the embryo ventral side up into the V shaped indentation of the mold in a slightly oblique position. Tightly fit two 0.1 millimeter minutian pins to a pin holder and use one pin to puncture the skin over the heart which should be visibly pulsing.Insert the pin through the hole in the space between the heart and the skin without puncturing the heart and position the inserted tip within the region where the incision will be made. Then rub the second pin against the inserted pin to make a linear incision and use both pins together to gently widen the incision, exposing the heart. To inject the DiI acetylated LDL solution, insert the glass pipette tip into the heart and inject 50 to 60 nano liters of the DiI acetylated LDL in approximately 10 ejection pulses.When all of the dye solution has been delivered confirm that the heart is still beating and transfer the embryo into a new Petri dish containing 0.1X MBS. After five to 10 minutes the tadpole should recover from anesthesia and begin to move. After an appropriate number of embryos have been injected, visually screen the correctly labeled anesthetized embryos under a fluorescence microscope discarding any animals that have other organs labeled.Embryos that have been insufficiently labeled can be injected again. Then capture images of the correctly labeled embryos. For a more thorough imaging of the blood vessels, fix re anesthetized embryos in 4%paraformaldehyde for one hour at room temperature protected from light for visualization by confocal microscopy.If a sufficient amount of diI acetylated LDL is injected into the heart, the posterior cardinal vein, or PCV, should be immediately visible under a fluorescence microscope. The intersomitic veins, or ISV's, emerge dorsally from the PCV in an anterior to posterior wave beginning at stage 36 and ending around stage 40 to 41 becoming lightly branched around stage 43. The PCV and ISV's grow in a stereotypical angiogenic pattern that is under tight developmental control.Interestingly, the knockdown of TIE-2 signaling by antisense morphalinos decreases the length and the complexity of the ISV's whereas expression of the constitutively active form of TIE-2 induces excessive ISV branching. A Vein Complexity Index can be calculated to assess the complexity of the ISV's and rendered paths can be generated to visualize the overall architecture of the embryonic Xenopus tropicalis vasculature. The original protocol was described for using Xenopus laevis by Levin and Colics and we adapted it for Xenopus tropicalis.Once mastered, this technique can be completed in one hour if it is performed properly. Before this procedure, genetic and pharmacological manipulations can be performed to answer additional questions such as which genes and signaling pathways regulate vascular development. Using this procedure the labeled vasculature can be imaged in an intact animal in real time providing a powerful tool for investigating the dynamics of vascular development.After watching this video you should have a good understanding of how to inject diI acetylated LDL into the heart of a Xenopus tropicalis tadpole to visualize it's vasculature.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

操作と<em&gt;インビトロ</emの&gt;成熟<em&gt;アフリカツメガエル</em細胞質内精子注入し&gt;卵母細胞、胚発生を研究するために

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

発生生物学

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

胚性マウスの心臓に免疫蛍光を用いて、心筋細胞の開発の分析

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

胚性メッケル軟骨でZebrabowクローン細胞分析によって軟骨細胞のインターカレーションと方向性増殖の可視化

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

幹細胞様<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚外植片を早期神経発達の特徴を研究するために<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

のトランスクリプトームプロファイリング<em&gt;生体内で</em二色マイクロアレイプラットフォームを使用&gt;産ウシ着床前の胚

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

開発にターゲットマイクロインジェクションのテクニック<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;腎臓

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

クリア胚ハーツにおける冠状血管の分析

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

細胞分化中のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路の光媒介可逆的調節<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚発生

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホール マウント免疫染色解析

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...