Name: visualization and quantitative analysis of embryonic angiogenesis in xenopus tropicalis
Uploaded: 2017-05-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis at JoVE.com

Este estudio se inspiró en el trabajo de Levine et al. , Que describió este método experimental y proporcionó una descripción completa del desarrollo vascular en Xenopus laevis. Damos las gracias a los miembros de nuestro laboratorio por su aporte. Este estudio fue apoyado por la Iniciativa de Investigación Futura de la Universidad de Yonsei de 2015 (2015-22-0095) y el Programa de Desarrollo de Tecnología Biológica y Médica de la Fundación Nacional de Investigación (NRF) financiado por el ministerio de Ciencia, TIC y Planificación del Futuro NRF - 2013M3A9D5072551)

Todos los experimentos cumplieron con los protocolos aprobados por el Colegio Universitario de Medicina de la Universidad de Medicina Institucional Cuidado de Animales y Comités de Uso. 1. Preparación de los embriones de Xenopus tropicalis NOTA: Los embriones de Xenopus tropicalis se produjeron como se describió anteriormente 10 , con ligeras modificaciones. Xenopus tropicalis embriones se realizaron de acuerdo con las tablas de Nie...

<ol>
	<li>Herbert, S. P., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+endothelial+cell+behaviour+during+blood+vessel+morphogenesis.">Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).</li><li>Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+vascular+morphogenesis+and+homeostasis+through+the+angiopoietin-Tie+system.">Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteries+and+veins:+making+a+difference+with+zebrafish.">Arteries and veins: making a difference with zebrafish.</a> Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).</li><li>Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+endothelial+cells+allows+in+vivo,+continuous+characterization+of+the+vascular+development+of+Xenopus+laevis.">Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis.</a> Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).</li><li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+Mediates+Ca2+-Dependent+Inhibition+of+Tie2+Signaling+and+Acts+as+a+Developmental+Brake+During+Embryonic+Angiogenesis.">Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell-stage+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo.</a> Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).</li><li>Elliott, K. L., Houston, D. W., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Xenopus+laevis+tissues+to+determine+the+ability+of+motor+neurons+to+acquire+a+novel+target.">Transplantation of Xenopus laevis tissues to determine the ability of motor neurons to acquire a novel target.</a> PLoS One. 8 (2), 55541 (2013).</li><li>Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tropicalis+as+a+model+organism+for+genetics+and+genomics:+past,+present,+and+future.">Xenopus tropicalis as a model organism for genetics and genomics: past, present, and future.</a> Methods Mol Biol. 917, 3-15 (2012).</li><li>Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+lysine+residues+of+plasma+lipoproteins+in+high+affinity+binding+to+cell+surface+receptors+on+human+fibroblasts.">Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts.</a> J Biol Chem. 253 (24), 9053-9062 (1978).</li><li>Showell, C., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+collection+and+in+vitro+fertilization+of+the+western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis.">Egg collection and in vitro fertilization of the western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (9), 5293 (2009).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).</li><li>Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Neurite+Tracer:+open+source+software+for+reconstruction,+visualization+and+analysis+of+neuronal+processes.">Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes.</a> Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).</li><li>Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+TrkB+signaling+in+presynaptic+retinal+ganglion+cells+mediates+axon+arbor+growth+and+synapse+maturation+during+the+establishment+of+retinotectal+synaptic+connectivity.">Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity.</a> J Neurosci. 27 (10), 2444-2456 (2007).</li><li>Cha, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionarily+repurposed+networks+reveal+the+well-known+antifungal+drug+thiabendazole+to+be+a+novel+vascular+disrupting+agent.">Evolutionarily repurposed networks reveal the well-known antifungal drug thiabendazole to be a novel vascular disrupting agent.</a> PLoS Biol. 10 (8), 1001379 (2012).</li><li>Ny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+Xenopus+laevis+reporter+model+to+study+lymphangiogenesis.">A transgenic Xenopus laevis reporter model to study lymphangiogenesis.</a> Biol Open. 2 (9), 882-890 (2013).</li><li>Bussmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteries+provide+essential+guidance+cues+for+lymphatic+endothelial+cells+in+the+zebrafish+trunk.">Arteries provide essential guidance cues for lymphatic endothelial cells in the zebrafish trunk.</a> Development. 137 (16), 2653-2657 (2010).</li><li>Li, X. M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+acetylated+low-density+lipoprotein+uptake+and+low+tyrosine+kinase+with+immunoglobulin+and+epidermal+growth+factor+homology+domains-2+(Tie2)+promoter+activity+distinguish+sinusoids+from+other+vessel+types+in+murine+bone+marrow.">High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow.</a> Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).</li></ol>

El protocolo presentado aquí fue desarrollado por Ali H. Brivanlou y sus colegas para investigar eventos de desarrollo durante la formación vascular en Xenopus laevis 4 , pero, como se muestra en este manuscrito, se puede aplicar a otros animales pequeños. La inyección de colorante en el corazón es simple de realizar, y toda la red vascular puede ser visualizada bajo un microscopio de disección de fluorescencia, así como un microscopio confocal. Si el colorante se inyecta en el co...

La vasculogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos de células endoteliales recién nacidas y la angiogénesis, la formación de nuevos vasos de vasos preexistentes, son dos procesos distintos que configuran la vasculatura embrionaria 1 . Cualquier desregulación en estos procesos da como resultado varias enfermedades del corazón y anomalías estructurales de los vasos. Además, el crecimiento tumoral está asociado con un crecimiento descontrolado de vasos. Como tal, los mecanismos moleculares subyacentes a la vasculogénesis y la angiogénesis son objeto de intensa investigación [ 2] . Xenopus y pez cebra son modelos de vertebrados atractivos para estudios de vasculogénesis y angiogénesis, por varias razones. Primero, sus embriones son pequeños; Por lo tanto, es relativamente fácil imaginar toda la vasculatura. En segundo lugar, el desarrollo embrionario es rápido; Sólo toma un par de días para que se desarrolle toda la vasculatura, durante cuyo tiempo la vascula en desarrollo<html> Una imagen. En tercer lugar, las intervenciones genéticas y farmacológicas antes y durante la formación de los vasos son fáciles de llevar a cabo, por ejemplo mediante la microinyección de morfolino nucleótidos antisentido (MOs) en el embrión en desarrollo oa través de la aplicación de ba~no de fármacos 3 , 4 , 5 . La ventaja única de Xenopus sobre el pez cebra es que las manipulaciones embriológicas pueden realizarse porque Xenopus sigue clivajes holoblásticos estereotípicos y el mapa embrionario del destino está bien definido 6 . Por ejemplo, es posible generar un embrión en el que sólo se manipula genéticamente un lado lateral mediante la inyección de un MO antisentido a una célula en la etapa de dos células. También es posible trasplantar el corazón primordio de un embrión a otro para determinar si el gen ejerce su función por una célula intrínseca o mecanismo -extrínsecoAsno = &quot;xref&quot;&gt; 7. Aunque estas técnicas se han desarrollado principalmente en Xenopus laevis , que es alotetraploide y por lo tanto no es ideal para los estudios genéticos , pueden aplicarse directamente a Xenopus tropicalis , una especie diploide estrechamente relacionada 8 . Una manera de visualizar la vasculatura en un embrión vivo de Xenopus es inyectar un colorante fluorescente para marcar los vasos sanguíneos. La lipoproteína de baja densidad acetilada (AcLDL) marcada con una molécula fluorescente tal como DiI es una sonda muy útil. A diferencia de la LDL no acetilada, la AcLDL no se une al receptor de LDL 9 sino que es endocitados por los macrófagos y las células endoteliales. La inyección de DiI-AcLDL en el corazón de un animal vivo resulta en el marcaje fluorescente específico de las células endoteliales, y toda la vasculatura puede ser visualizada por microscopía de fluorescencia en embriones vivos o fijos [ 4] . Aquí prestamosDe protocolos detallados para la visualización y cuantificación de vasos sanguíneos utilizando DiI-AcLDL en Xenopus tropicalis ( Figura 1 ). Proporcionamos puntos prácticos clave, con ejemplos de experimentos exitosos y sin éxito. Además, proporcionamos un método sencillo para el análisis cuantitativo de la complejidad vascular, que podría ser útil para evaluar los efectos de factores genéticos y ambientales en la conformación de la red vascular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="539">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">35mm Petri dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">10035</td>
			<td style="width:180px;">Sylgard mold frame</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">60mm Petri dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">10060</td>
			<td>Embryo raising tray</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Borosilicate Glass</td>
			<td style="width:113px;">Sutter instrument</td>
			<td style="width:93px;">B100-50-10</td>
			<td>Needle for injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">BSA</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">A3059-10G</td>
			<td>Coating reagent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">CaCl2</td>
			<td style="width:113px;">D.S.P.GR Reagent</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>0.1X MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Coverslip</td>
			<td style="width:113px;">Superior</td>
			<td style="width:93px;">HSU-0111520</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">DiI-AcLDL</td>
			<td style="width:113px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:93px;">L3484</td>
			<td>Vessel staining solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">FBS</td>
			<td style="width:113px;">Hyclone</td>
			<td style="width:93px;">SH.30919.02</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Fiber Optical Illuminator</td>
			<td style="width:113px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:93px;">Z-LITE-Z</td>
			<td>Light</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Ficoll</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">F4375</td>
			<td>Injection buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:113px;">Sutter instrument</td>
			<td style="width:93px;">P-97</td>
			<td>Injection needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Forcep</td>
			<td style="width:113px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:93px;">11255-20</td>
			<td style="width:180px;">For embryo hatching and 
			needle tip cutting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Glass Bottom dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">100350</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">hCG</td>
			<td style="width:113px;">MNS Korea</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>For priming of frogs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">HEPES</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">H3375</td>
			<td>Buffering agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Incubator</td>
			<td style="width:113px;">Lab. Companion</td>
			<td style="width:93px;">ILP-02</td>
			<td>For raising embryos</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">KCl</td>
			<td style="width:113px;">DAEJUNG</td>
			<td style="width:93px;">6566-4400</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">L15 medium</td>
			<td style="width:113px;">Gibco</td>
			<td style="width:93px;">11415-114</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">L-cysteine</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">168149-100G</td>
			<td>De-jellying reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">MgSO4</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">M7506</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Microtube</td>
			<td style="width:113px;">Axygen</td>
			<td style="width:93px;">MCT-175-C-S</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">MS222</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">E10521</td>
			<td>Anesthetic powder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">NaCl</td>
			<td style="width:113px;">DAEJUNG</td>
			<td style="width:93px;">7647-14-5</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">NaOH</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">S-0899</td>
			<td>pH adjusting reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P6148</td>
			<td>Fixatives</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">PBS</td>
			<td style="width:113px;">BIOSESANG</td>
			<td style="width:93px;">P2007</td>
			<td>Buffer for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">pH paper</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P4536-100EA</td>
			<td>For confirming pH</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">PICO-LITER INJECTOR</td>
			<td style="width:113px;">Waner instruments</td>
			<td style="width:93px;">PLI-100A</td>
			<td>For injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Pin</td>
			<td style="width:113px;">Pinservice</td>
			<td style="width:93px;">26002-10</td>
			<td>For incision</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Pinholder</td>
			<td style="width:113px;">Scitech Korea</td>
			<td style="width:93px;">26016-12</td>
			<td>For incision</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Precision Stereo Zoom Binocular Microscope</td>
			<td style="width:113px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:93px;">PZMIII</td>
			<td>For visual screening</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:153px;">Standard Manual Control Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Waner instruments</td>
			<td style="width:93px;">W4 64-0056</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">SYLGARD 184 Kit</td>
			<td style="width:113px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>For DiI injection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Transfer pipette</td>
			<td style="width:113px;">Korea Ace Scientific Co.</td>
			<td style="width:93px;">YM.B78-400</td>
			<td>For eggs and 
			embryo collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantitative analysis of embryonic angiogenesis in xenopus tropicalis

Los vasos sanguíneos suministran oxígeno y nutrientes en todo el cuerpo, y la formación de la red vascular está bajo un estricto control del desarrollo. La visualización in vivo eficaz de los vasos sanguíneos y la cuantificación confiable de su complejidad son fundamentales para comprender la biología y la enfermedad de la red vascular. Aquí, proporcionamos un método detallado para visualizar los vasos sanguíneos con un colorante fluorescente comercialmente disponible, plasma humano acetilado de lipoproteína de baja densidad DiI complejo (DiI-AcLDL), y para cuantificar su complejidad en Xenopus tropicalis . Los vasos sanguíneos pueden ser etiquetados mediante una simple inyección de DiI-AcLDL en el corazón de un embrión y los vasos sanguíneos de todo el embrión se pueden visualizar en embriones vivos o fijos. Combinada con la perturbación génica por la microinyección dirigida de ácidos nucleicos y / o la aplicación en el baño de reactivos farmacológicos, las funciones de un gen o de una vía de señalización sobre el desarrollo vascular pueden ser inveEstigmatizados en una semana sin recurrir a sofisticados animales modificados genéticamente. Debido al sistema venoso bien definido de Xenopus y su angiogénesis estereotípica, el brote de vasos preexistentes, la complejidad de los vasos pueden ser cuantificados eficientemente después de experimentos de perturbación. Este protocolo relativamente simple debe servir como una herramienta de fácil acceso en diversos campos de la investigación cardiovascular.

Cronología de los experimentos (Figuras 1 y 2) Poco después de la fecundación, la microinyección dirigida se puede realizar para modular la expresión génica. Por ejemplo, se puede inyectar un MO antisentido que se une específicamente al codón de iniciación del ARNm de Tie2 endógeno, inhibiendo la traducción del mRNA diana de Tie2 por impedimento estérico. Un MO puede conjugarse con fluoresceína para el fácil rastreo...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis at JoVE.com

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Este protocolo demuestra un método basado en la fluorescencia para visualizar la vasculatura y para cuantificar su complejidad en Xenopus tropicalis . Los vasos sanguíneos pueden visualizarse minutos después de la inyección de un colorante fluorescente en el corazón de un embrión después de manipulaciones genéticas y / o farmacológicas para estudiar el desarrollo cardiovascular in vivo .

Visualización y análisis cuantitativo de la angiogénesis embrionaria<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

The overall goal of this procedure is to visualize the vasculature of Xenopus tropicalis tadpoles. This method can help answer key questions in the field of cardiovascular biology such as how angiogenesis is regulated. The main advantage of this technique is that blood vessels in an intact well type embryo can be visualized by a simple fluorescent dye injection.Begin by using a micro loader to fill a tapered glass micro pipette with approximately five microliters of clear diI acetylated LDL solution taking care that no precipitated particles are loaded. Under a dissecting microscope use a fine pair of number 55 forceps to clip the tip of the pipette to adjust the volume of the uploaded complex and set the pressure controlled injection system to eject approximately five nano liters of solution per injection. Then submerge the pipette tip in 0.04%MS-222 in 0.1X modified Barth's saline or MBS in a custom made Sylgard mold.Next transfer Xenopus tropicalis embryo to the Sylgard mold and confirm complete sedation with a lack of response to dorsal fin stimulation. Under the dissecting microscope load the embryo ventral side up into the V shaped indentation of the mold in a slightly oblique position. Tightly fit two 0.1 millimeter minutian pins to a pin holder and use one pin to puncture the skin over the heart which should be visibly pulsing.Insert the pin through the hole in the space between the heart and the skin without puncturing the heart and position the inserted tip within the region where the incision will be made. Then rub the second pin against the inserted pin to make a linear incision and use both pins together to gently widen the incision, exposing the heart. To inject the DiI acetylated LDL solution, insert the glass pipette tip into the heart and inject 50 to 60 nano liters of the DiI acetylated LDL in approximately 10 ejection pulses.When all of the dye solution has been delivered confirm that the heart is still beating and transfer the embryo into a new Petri dish containing 0.1X MBS. After five to 10 minutes the tadpole should recover from anesthesia and begin to move. After an appropriate number of embryos have been injected, visually screen the correctly labeled anesthetized embryos under a fluorescence microscope discarding any animals that have other organs labeled.Embryos that have been insufficiently labeled can be injected again. Then capture images of the correctly labeled embryos. For a more thorough imaging of the blood vessels, fix re anesthetized embryos in 4%paraformaldehyde for one hour at room temperature protected from light for visualization by confocal microscopy.If a sufficient amount of diI acetylated LDL is injected into the heart, the posterior cardinal vein, or PCV, should be immediately visible under a fluorescence microscope. The intersomitic veins, or ISV's, emerge dorsally from the PCV in an anterior to posterior wave beginning at stage 36 and ending around stage 40 to 41 becoming lightly branched around stage 43. The PCV and ISV's grow in a stereotypical angiogenic pattern that is under tight developmental control.Interestingly, the knockdown of TIE-2 signaling by antisense morphalinos decreases the length and the complexity of the ISV's whereas expression of the constitutively active form of TIE-2 induces excessive ISV branching. A Vein Complexity Index can be calculated to assess the complexity of the ISV's and rendered paths can be generated to visualize the overall architecture of the embryonic Xenopus tropicalis vasculature. The original protocol was described for using Xenopus laevis by Levin and Colics and we adapted it for Xenopus tropicalis.Once mastered, this technique can be completed in one hour if it is performed properly. Before this procedure, genetic and pharmacological manipulations can be performed to answer additional questions such as which genes and signaling pathways regulate vascular development. Using this procedure the labeled vasculature can be imaged in an intact animal in real time providing a powerful tool for investigating the dynamics of vascular development.After watching this video you should have a good understanding of how to inject diI acetylated LDL into the heart of a Xenopus tropicalis tadpole to visualize it's vasculature.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

La manipulación y<em&gt; In Vitro</em&gt; La maduración de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Los ovocitos, seguido de inyección intracitoplasmática de espermatozoides, para estudiar el desarrollo embrionario

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Análisis para el Desarrollo de los cardiomiocitos mediante inmunofluorescencia en el corazón de embriones de ratón

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualización de condrocitos Intercalación y direccional proliferación a través de análisis celular clonal Zebrabow en el cartílago de la embrionaria Meckel

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Celular-como Stem<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionarias explantes para Estudiar Características Temprana del Desarrollo Neural<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptoma de perfiles de<em&gt; In-Vivo</em&gt; Productos fabricados preimplantación de embriones bovinos mediante plataforma de microarrays de dos colores

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Técnica de microinyección a Target a los países en desarrollo<em&gt; Xenopus</em&gt; riñón

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Análisis de los vasos coronarios en los corazones embrionarias aclarados

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Modulación reversible mediada por luz de la vía de la proteína quinasa activada por mitógeno durante la diferenciación celular y<em&gt; Xenopus</em&gt; Desarrollo embrionario

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Análisis de la inmunofluorescencia de Whole-mount cuantitativa de las poblaciones progenitoras cardiacas en embriones de ratón

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...