Name: isolation of intermediate filament proteins from multiple mouse tissues to study aging-associated post-translational modifications
Uploaded: 2017-05-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد نيه منح نيه R01 DK110355، DK093776 [نتس]، DK102450 [نتس]، و P30 DK034987 [إلى ونك تشابل هيل]. المؤلفين أشكر ديكشيتا رامانارايانان للمساعدة مع قر وتجارب لطخة الغربية.

تمت الموافقة على البروتوكول وأداء وفقا للجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية (إاكوك) في جامعة كارولينا الشمالية. 1 - الأعمال التحضيرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تريتون-X العازلة (1٪ تريتون X-100، 5 ملي إثيلينديامين?...

الأساليب التي تمكن توصيف البيوكيميائية للبروتينات إف يمكن أن تكون مفيدة لفهم الظواهر الفيزيولوجية المرضية العديدة في نظم الثدييات، لأن البروتينات إف على حد سواء علامات ومغيرات من الإجهاد الخلوي والأنسجة 29 . ويستند المبدأ الكامن وراء الطريقة الحالية ع?...

<html> إفس هي عائلة من البروتينات التي في البشر يتم ترميزها من قبل 73 الجينات وتصنيفها إلى ستة أنواع رئيسية: أنواع I-إيف هي السيتوبلازمية (على سبيل المثال كيراتينس الظهارية والشعر (K)، ميوسيت ديسمين، العصبية، الدبقية الليفي الحمضية البروتين (غفاب) و اخرين)؛ النوع الخامس هي اللامين النووي. والنوع السادس هي إفس في عدسة العين 1 . من حيث التنظيم الجزيئي، والبروتينات إف لديها ثلاثة مجالات مشتركة: نطاق &quot;ملف&quot; قضيب ملفوفة للغاية، و &quot;الرأس&quot; و &quot;ذيل&quot; المجالات الكروية. إذا تجمع تيترامرز البروتين لتشكيل السلائف خيوط قصيرة، والتي يتم تضمينها في نهاية المطاف في خيوط ناضجة التي تشكل الهياكل الهيكلية الهيكلية والهياكل النووية الحيوية المشاركة في الحماية الميكانيكية 2 ، والاستشعار الإجهاد 3 ، 4 ، وتنظيم النسخ 5 والنمو، وغيرها من الوظائف الخلوية الحرجة&quot;&gt; 1 ، 6 ، 7 . وتسلط الضوء على أهمية وظيفية للنظام إف من وجود العديد من الأمراض البشرية الناجمة عن الطفرات الصفر في الجينات إف، بما في ذلك الاعتلال العصبي، اعتلال عضلي، واضطرابات هشاشة الجلد، اختلالات التمثيل الغذائي، ومتلازمات الشيخوخة المبكرة 8 . بعض الطفرات الجينية إف لا تسبب، ولكن تأهب ناقلاتهم إلى تطور المرض، مثل كيراتينس الظهارية بسيطة في أمراض الكبد 9 . ويرجع هذا الأخير إلى وظائف حرجة واقية من الإجهاد إفس في الظهارة. إفس بشكل عام هي من بين البروتينات الخلوية الأكثر وفرة في ظل الظروف القاعدية، ولكن هي أكثر بقوة الناجم خلال أنواع مختلفة من الإجهاد 10 . على سبيل المثال، أظهرت الدراسات الحديثة تقييم التغيرات على نطاق البروتيوم في الديدان الخيطية C. ايليجانس أن إفس متعددة هي أوبريغولاتد للغاية وعرضة لتجميععلى خلال الشيخوخة العضوية 11 ، 12 . منذ الحفاظ على بنية إف المناسبة أمر ضروري للمقاومة الخلوية لمختلف أشكال الإجهاد 10 ، إف التجميع قد تسهم أيضا في الانخفاض الوظيفي خلال الشيخوخة. ومع ذلك، الدراسات على مستوى العضوية فحص البروتينات متعددة الثدييات إف عبر الأنسجة المختلفة التي تمر بالإجهاد غير موجودة. إفس هي هياكل ديناميكية للغاية التي تتكيف مع تلبية مطالب الخلوية. كيراتينس، على سبيل المثال، الخضوع للدراجات البيولوجية مستقلة بين ذوبان (غير خيطي) وغير قابلة للذوبان (الخيطية) بروتين تجمع 13 . في ظل الظروف الفسيولوجية العادية حوالي 5٪ يمكن استخراج مجموع K8 / K18 تجمع في المنظفات خالية من العازلة، بالمقارنة مع ما يقرب من 20٪ التي يمكن أن تذوب في المنظفات غير الأيونية نونيديت P-40، وهو قابل للمقارنة كيميائيا كيميائيا ل تريتون- X100 14 ، </sأوب&gt; 15 . خلال الانقسام هناك زيادة ملحوظة في الذوبان من نوع بسيط K8 الظهارية و K18 14 ، وهو أقل وضوحا في كيراتينس البشرة ولكن أكثر وضوحا في فيمنتين والنوع الثالث من البروتينات إيف الثالث 15 ، 16 . يتم تنظيم خصائص الذوبان من البروتينات إف بإحكام من قبل الفسفرة، وهو مفتاح بعد متعدية تعديل (بتم) لإعادة خيوط الذوبان والذوبان 17 ، 18 ، 19 ، 20 . وتخضع معظم المؤسسات المالية الدولية لتنظيم واسع من قبل عدد من بتمس في المواقع المحفوظة، مما أدى إلى تغييرات وظيفية 17 . والغرض من هذا الأسلوب هو إدخال المحققين الذين هم جديدون إلى حقل إف إلى الاستخراج البيوكيميائية والأساليب التحليلية لدراسة البروتينات إف عبر أنسجة الماوس متعددة. محددالحليف، ونحن نركز على عزل البروتينات إف باستخدام طريقة استخراج الملح عالية وتقييم التغيرات في بتمس عن طريق الكتلة الطيفية والأجسام المضادة التي تستهدف بتم. هذه الأساليب بناء على الإجراءات المنشورة سابقا 21 ولكن تشمل تعديلات لاستخراج أنواع مختلفة من البروتين إف للكشف عن آلية مشتركة للتنظيم عبر الأسرة إف. على سبيل المثال، K8 أسيتيلاتيون في بقايا يسين معين ينظم تنظيم خيوط، في حين أن هيبيراسيتيلاتيون يعزز K8 عدم القابلية للذوبان وتشكيل الكلي 22 . وقد كشفت الدراسات التنميط البروتينات العالمية الأخيرة بالإضافة إلى ذلك أن معظم البروتينات إف محددة الأنسجة هي أيضا تستهدف الاستمالة وأن معظم إف المواقع تقتصر تقتصر على نطاق قضيب المحفوظة للغاية. وهذا يبرز الحاجة إلى أساليب مناسبة للتنميط العالمي للنظام إف. كما نقدم طريقة سريعة لعزل البروتينات إف من أنسجة متعددة باستخدام التجانس الآلي في أوبتيميزينغ ليسينغ مصفوفة. الاستعدادات الناتجة هي مناسبة لتحليل بتم المصب عن طريق مطياف الكتلة وغيرها من الأساليب.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10009</td>
			<td>immunoprecipitation beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>for buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink RNA mini kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12183018</td>
			<td>RNA extraction from tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink DNAse set</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12185010A</td>
			<td>on column DNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamag-2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>magnet for use with dynabeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelCode Blue Stain Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24592</td>
			<td>mass spectrometry-compatible gel stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td>for use in western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA reverse transcription kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4368813</td>
			<td>for use in gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proflex 3x32-well PCR System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4484073</td>
			<td>PCR system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF transfer membrane&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88520</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Up SYBR master mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A25778</td>
			<td>for qPCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM7020</td>
			<td>solution for tissue storage prior to RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex 4-20% Tris Glycine Gel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>Precast protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Keratin 8 antibody (TS1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA514428</td>
			<td>for western blot detection of K8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA511883</td>
			<td>for western blot detection of vimentin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Glycine Transfer Buffer (25X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC3675</td>
			<td>for wet transfer of protein gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SDS Sample Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>for preparing protein gel samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Glycine SDS Running Buffer (10X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC26755</td>
			<td>for running protein gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing beads - Matrix D</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116913100</td>
			<td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing beads - Matrix SS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116921100</td>
			<td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-LITE</td>
			<td>measurement of protein and nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>EQ03119</td>
			<td>Automated tissue homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intermediate filament proteins from multiple mouse tissues to study aging-associated post-translational modifications

الشعيرات المتوسطة (إفس)، جنبا إلى جنب مع خيوط الأكتين والأنابيب الدقيقة، تشكل الهيكل الخلوي - عنصرا هيكليا حاسما في كل خلية. أداء طبيعي توفر إفس الخلايا مع مرونة الميكانيكية والقدرة على الإجهاد، في حين أن خلل هيكلي خلل إف يخل بالصحة الخلوية، وكان مرتبطا مع العديد من الأمراض البشرية. التعديلات بعد متعدية (بتمس) تنظم بشكل حاسم ديناميات إف استجابة للتغيرات الفسيولوجية وتحت ظروف الإجهاد. ولذلك، فإن القدرة على رصد التغييرات في توقيع بتم من إفس يمكن أن تسهم في فهم وظيفي أفضل، وتكييف في نهاية المطاف، من نظام إف كمجيب مجيب أثناء الإصابة الخلوية. ومع ذلك، فإن العدد الكبير من البروتينات إف، التي يتم ترميزها من قبل أكثر من 70 الجينات الفردية ويعبر عنها بطريقة تعتمد على الأنسجة، هو التحدي الرئيسي في فرز الأهمية النسبية لمختلف بتمس. تحقيقا لهذه الغاية، والأساليب التي تمكن من مراقبة بتمس على إف البروتيناتعلى مستوى الكائن الحي، بدلا من أفراد الأسرة المعزولين، أن يسرع التقدم في مجال البحوث في هذا المجال. هنا، نقدم طرق البيوكيميائية لعزل الكلي، المنظفات القابلة للذوبان، وجزء مقاوم للمنظفات من البروتينات إف من 9 أنسجة الماوس المختلفة (الدماغ والقلب والرئة والكبد والأمعاء الدقيقة والأمعاء الغليظة والبنكرياس والكلى، و طحال). نحن أيضا إظهار بروتوكول الأمثل لعزل سريع من البروتينات إف باستخدام مصفوفة ليسينغ والتجانس الآلي من أنسجة الماوس المختلفة. بروتوكول الآلي هو مفيد ل إفس التنميط في التجارب ذات حجم عينة عالية (كما هو الحال في نماذج المرض التي تنطوي على حيوانات متعددة والمجموعات التجريبية). ويمكن استخدام العينات الناتجة عن مختلف التحليلات المصب، بما في ذلك التنميط القائم على الطيف الكتلي بتم. باستخدام هذه الأساليب، ونحن نقدم بيانات جديدة لإظهار أن إف البروتينات في أنسجة الماوس المختلفة (الدماغ والكبد) تخضع لتغييرات موازية فيما يتعلق إكسبريسمستويات سيون و بتمس خلال الشيخوخة.

وهناك طريقة سريعة جديدة لارتفاع استخراج الملح المستندة إلى البروتينات إف من أنسجة الماوس متعددة باستخدام مصفوفة ليسينغ. تم تعديل الطريقة التقليدية 25</s...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications at JoVE.com

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

في هذه الطريقة، نقدم الإجراءات البيوكيميائية لعزل سريعة وفعالة من البروتينات خيوط (إف) وسيطة من أنسجة الماوس متعددة. يمكن استخدام إفس معزولة لدراسة التغيرات في التعديلات بعد متعدية من قبل الطيف الكتلي وغيرها من المقايسات الكيميائية الحيوية.

عزل بروتينات الشعيرة المتوسطة من أنسجة الفئران المتعددة لدراسة التعديلات المرتبطة بالشيخوخة بعد الترجمة

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

طريقة لقياس الحمض النووي الريبي<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine تعديلات في الخلايا والأنسجة

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

النووي التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي لتحديد Phosphorylations متعددة من جوهريا المختلين البروتينات

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

استخدام نظام إثراء إيمونوبريسيبيتيشن شاملة لتحديد ملف تعريف تعديل بوستترانسلاشونال ذاتية للبروتينات المستهدفة

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

عزل جلوميرولي و في فيفو وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

يبحث إلى الخارج: عزل البوليمرات الكربوهيدرات السيانوبكتيرية المفرج عنها والبروتينات

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

تنميط اوبيكويتين و اوبيكويتين-مثل التعديلات اللاحقة الانتقالية وتحديد التعديلات الهامه

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

المقطع المستعرض من الأرز الناضج(Oryza sativa L.) حبات لمسح المجهر الإلكتروني التصوير باستخدام نصائح ماصة كدعم تعطيل

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

تنقية توبولين مع التعديلات ما بعد النقل الخاضعة للرقابة وIsotypes من مصادر محدودة من قبل دورات البلمرة- Depolymerization

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

تنقية بروتينات p53 في كل مكان من خلايا الثدييات

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

مطيافية نيوترونية عالية الدقة لدراسة ديناميكيات بيكو ثانية-نانوثانية للبروتينات ومياه الترطيب

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...