Name: isolation of intermediate filament proteins from multiple mouse tissues to study aging-associated post-translational modifications
Uploaded: 2017-05-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH-bevillingerne NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] og P30 DK034987 [til UNC-Chapel Hill]. Forfatterne takker Deekshita Ramanarayanan for hjælp med qPCR og western blot-eksperimenter.

Protokollen godkendes og udføres i overensstemmelse med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of North Carolina. 1. Forberedelser <ol><li> Fremstil Triton-X-buffer (1% Triton X-100, 5 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), opsaml volumen i phosphatpufret saltvand (PBS), pH 7,4). For at gøre 500 ml: omrør 5 ml hver af Triton X-100 og 500 mM EDTA i 490 ml PBS, pH 7,4. Opbevar Triton-X bufferopløsning ved 4 ° C. </li><li> Fremstil høj saltbuffer (10 mM Tris-HCI, pH 7,6, 140 mM ...

Metoder, der muliggør biokemisk karakterisering af IF-proteiner, kan være nyttige til at forstå talrige patofysiologiske fænomener i pattedyrsystemer, da IF-proteiner er både markører og modulatorer af cellulær og vævsspænding 29 . Princippet bag den nuværende metode er baseret på de indledende procedurer udviklet i 1970&#39;erne og 1980&#39;erne for at isolere, adskille og rekonstruere IF-proteiner fra celler og væv, som generelt anvender lav- og højt saltopløsninger og Triton-X100...

<html> IF&#39;er er en familie af proteiner, som i humane er kodet af 73 gener og er kategoriseret i seks hovedtyper: Type I-IV er cytoplasmatisk ( fx epitel- og hårkeratiner (K), myocyt desmin, neurofilamenter, glialfibrillære sure proteiner (GFAP), og andre); Type V er nukleare laminer; Og type VI er IF&#39;er i øjelinsen 1 . Med hensyn til deres molekylære organisation har IF-proteiner tre almindelige domæner: et stærkt bevaret &quot;coiled-coil&quot; -stang-domæne og globulære &quot;hoved&quot; og &quot;hale&quot; domæner. Hvis proteintetramerer samles for at danne korte filamentprecursorer, som i sidste ende indgår i modne filamenter, der former dynamiske cytoskeletale og nukleoskeletale strukturer involveret i mekanisk beskyttelse 2 , spændingsføler 3 , 4 , regulering af transkription 5 og vækst og andre kritiske cellulære funktioner&quot;&gt; 1 , 6 , 7 . Den funktionelle betydning af IF-systemet fremhæves af eksistensen af ​​mange humane sygdomme forårsaget af missense-mutationer i IF-gener, herunder neuropatier, myopatier, hudfraglighedsforstyrrelser, metaboliske dysfunktioner og for tidlig aldringssyndrom 8 . Nogle IF-genmutationer forårsager ikke, men prædisponerer deres bærere for sygdomsprogression, såsom de enkle epitelkeratiner i leversygdom 9 . Sidstnævnte skyldes de kritiske stressbeskyttende funktioner af IF&#39;er i epithelia. IF&#39;er generelt er blandt de mest almindelige cellulære proteiner under basale betingelser, men er yderligere stærkt induceret under forskellige typer stress 10 . For eksempel viste nylige undersøgelser, der evaluerede proteom-brede ændringer i nematoden C. elegans, at flere IF&#39;er er stærkt upregulerede og tilbøjelige til aggregeringPå under organisatorisk aldring 11 , 12 . Da vedligeholdelse af en ordentlig IF-struktur er afgørende for cellulær modstandsdygtighed over for forskellige former for stress 10 , kan IF-aggregering også bidrage til det funktionelle fald under aldring. Imidlertid mangler undersøgelser af organismer på niveau med flere pattedyr IF-proteiner på tværs af forskellige væv under stress. IF&#39;er er stærkt dynamiske strukturer, der tilpasser sig til at opfylde cellulære krav. Keratiner gennemgår for eksempel en biosyntese-uafhængig cykling mellem opløselig (ikke-filamentøs) og uopløselig (trådformet) proteinpulje 13 . Under normale fysiologiske forhold kan ca. 5% den samlede K8 / K18 pool ekstraheres i vaskemiddelfri buffer i forhold til ca. 20%, der kan opløses i det nonioniske vaskemiddel Nonidet P-40, som er biokemisk sammenlignelig med Triton- X100 14 , </sOp&gt; 15 . Under mitose er der en bemærkelsesværdig stigning i opløseligheden af ​​epitel K8 og K1814 af simple type, hvilket er mindre tydeligt i epidermale keratiner, men mere tydeligt i vimentin og andre type III IF-proteiner 15 , 16 . Opløselighedsegenskaber for IF-proteiner reguleres tæt ved phosphorylering, en nøgle post-translationel modifikation (PTM) til filamentomlægning og opløselighed 17 , 18 , 19 , 20 . De fleste IF&#39;er gennemgår omfattende regulering af en række PTM&#39;er på konserverede steder, hvilket resulterer i funktionelle ændringer 17 . Formålet med denne metode er at introducere efterforskere, der er nye for IF-området til biokemisk udvinding og analysemetoder til undersøgelse af IF-proteiner på tværs af flere musevæv. BestemtAllieret fokuserer vi på isolering af IF-proteiner ved anvendelse af en højsaltekstraktionsmetode og vurdering af ændringer i PTM&#39;er via massespektrometri og ved PTM-målretningsantistoffer. Disse fremgangsmåder bygger på tidligere offentliggjorte procedurer 21, men indbefatter modifikationer til ekstraktion af forskellige IF-proteintyper for at afdække fælles mekanisme for regulering over IF-familien. For eksempel regulerer K8-acetylering ved en specifik lysinrest en filamentorganisation, medens hyperacetylering fremmer K8-uløselighed og aggregatdannelse 22 . Nylige globale proteomiske profileringsundersøgelser har desuden afsløret, at de fleste vævsspecifikke IF-proteiner også er mål for acetylering, og at de fleste IF-acetyleringssteder er begrænset til det stærkt konserverede stangdomæne. Dette fremhæver behovet for metoder, der er egnede til global profilering af IF-systemet. Vi introducerer også en hurtig metode til at isolere IF proteiner fra flere væv ved hjælp af automatiseret homogenisering i optiMiseret lyseringsmatrix. De resulterende præparater er egnede til nedstrøms PTM analyse via massespektrometri og andre fremgangsmåder.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10009</td>
			<td>immunoprecipitation beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>for buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink RNA mini kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12183018</td>
			<td>RNA extraction from tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink DNAse set</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12185010A</td>
			<td>on column DNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamag-2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>magnet for use with dynabeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelCode Blue Stain Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24592</td>
			<td>mass spectrometry-compatible gel stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td>for use in western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA reverse transcription kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4368813</td>
			<td>for use in gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proflex 3x32-well PCR System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4484073</td>
			<td>PCR system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF transfer membrane&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88520</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Up SYBR master mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A25778</td>
			<td>for qPCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM7020</td>
			<td>solution for tissue storage prior to RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex 4-20% Tris Glycine Gel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>Precast protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Keratin 8 antibody (TS1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA514428</td>
			<td>for western blot detection of K8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA511883</td>
			<td>for western blot detection of vimentin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Glycine Transfer Buffer (25X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC3675</td>
			<td>for wet transfer of protein gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SDS Sample Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>for preparing protein gel samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Glycine SDS Running Buffer (10X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC26755</td>
			<td>for running protein gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing beads - Matrix D</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116913100</td>
			<td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing beads - Matrix SS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116921100</td>
			<td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-LITE</td>
			<td>measurement of protein and nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>EQ03119</td>
			<td>Automated tissue homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intermediate filament proteins from multiple mouse tissues to study aging-associated post-translational modifications

Mellemliggende filamenter (IF&#39;er) sammen med actinfilamenter og mikrotubuli danner cytoskelettet - et kritisk strukturelt element i hver celle. Normal funktion IF&#39;er tilvejebringer celler med mekanisk og spændingsfasthed, mens en dysfunktionel IF cytoskelet kompromitterer cellulær sundhed og har været forbundet med mange menneskelige sygdomme. Post-translationelle modifikationer (PTM) regulerer kritisk IF-dynamik som reaktion på fysiologiske ændringer og under stressbetingelser. Derfor kan evnen til at overvåge ændringer i PTM-signaturen af ​​IF&#39;er bidrage til en bedre funktionel forståelse og i sidste ende konditionering af IF-systemet som en stressrespons under cellulær skade. Imidlertid er det store antal IF-proteiner, som er kodet af over 70 individuelle gener og udtrykt på en vævsafhængig måde, en stor udfordring ved at sortere den relative betydning af forskellige PTM&#39;er. Til dette formål, metoder, der muliggør overvågning af PTM&#39;er på IF-proteinerPå et organismer-bredt niveau, snarere end for isolerede familiemedlemmer, kan fremskynde forskningsfremskridt på dette område. Her præsenterer vi biokemiske metoder til isolering af det totale, detergentopløselige og vaskemiddelresistente brøkdel af IF-proteiner fra 9 forskellige musevæv (hjerne, hjerte, lunge, lever, tyndtarme, tyktarm, bugspytkirtel, nyre og milt). Vi demonstrerer yderligere en optimeret protokol til hurtig isolering af IF proteiner ved hjælp af lyseringsmatrix og automatiseret homogenisering af forskellige musevæv. Den automatiske protokol er nyttig til profilering af IF&#39;er i eksperimenter med højt prøvevolumen (såsom i sygdomsmodeller involverende flere dyr og eksperimentelle grupper). De resulterende prøver kan anvendes til forskellige downstream analyser, herunder massespektrometri-baseret PTM profilering. Ved anvendelse af disse metoder giver vi nye data til at vise, at IF-proteiner i forskellige musevæv (hjerne og lever) undergår parallelle ændringer med hensyn til deres ekspresSion niveauer og PTMs under aldring.

En ny hurtig metode til høj saltbaseret ekstraktion af IF-proteiner fra flere musevæv under anvendelse af lyseringsmatrix. Den traditionelle metode 25 , 26 til isolering af hovedparten af ​​den mellemliggende filamentproteinfraktion fra epitelvæv blev modificeret her for at indbefatte 9 forskellige organer ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications at JoVE.com

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

I denne metode præsenterer vi biokemiske procedurer til hurtig og effektiv isolering af intermediære filament (IF) proteiner fra flere musevæv. Isolerede IF&#39;er kan anvendes til at studere ændringer i posttranslationelle modifikationer ved massespektrometri og andre biokemiske analyser.

Isolering af Intermediate Filament Proteiner fra Multiple Musvæv til Studie Aging-associerede Post-translationelle Modifikationer

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

En metode til måling af RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Ændringer i celler og væv

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for Identifikation af flere fosforyleringer af Intrinsically Disordered Proteiner

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Udnytte en omfattende Immunoprecipitation berigelse System for at identificere en endogen posttranslationel modifikation profil for Target proteiner

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolering af Glomeruli og In Vivo mærkning af glomerulær celle overflade proteiner

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Ser udad: isolering af Cyanobakteriale frigivne kulhydratpolymerer og proteiner

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Profilering af Ubiquitin og Ubiquitin-lignende afhængige posttranslationelle ændringer og identificering af væsentlige ændringer

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tværgående 2000 af ældre ris(Oryza sativa L.) Kerner til scanning elektronmikroskopi imaging ved hjælp af pipette tips som immobilisering Support

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

Rensning af Tubulin med kontrollerede posttranslationale modifikationer og isotyper fra begrænsede kilder ved polymerisering-depolymeriseringscyklusser

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Oprensning af allestedsnærværende p53-proteiner fra pattedyrceller

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Neutronspektroskopi med høj opløsning til undersøgelse af picosekund-nanosekunddynamik af proteiner og hydreringsvand

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...