Name: isolation of intermediate filament proteins from multiple mouse tissues to study aging-associated post-translational modifications
Uploaded: 2017-05-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de NIH-subsidies NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] en P30 DK034987 [naar UNC-Chapel Hill]. De auteurs bedanken Deekshita Ramanarayanan voor hulp bij qPCR en western blot experimenten.

Het protocol is goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met het Institutioneel Diervoeder- en Gebruikskomitee (IACUC) aan de Universiteit van Noord-Carolina. 1. Voorbereidingen <ol><li> Bereid Triton-X buffer (1% Triton X-100, 5 mM ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA) op, haal volume op in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4). Om 500 ml te maken: roer 5 ml elk van Triton X-100 en 500 mM EDTA in 490 ml PBS, pH 7,4. Bewaar Triton-X buffer oplossing bij 4 ° C. </li><li> Bereid een hoge zoutbuffer o...

Methoden die biochemische karakterisering van IF-eiwitten mogelijk maken, kunnen nuttig zijn om talloze pathofysiologische verschijnselen in zoogdierstelsels te begrijpen, aangezien IF-eiwitten beide markers en modulatoren zijn van cellulair en weefselspanning 29 . Het principe achter de huidige methode is gebaseerd op de initiële procedures die in de jaren 1970 en 1980 zijn ontwikkeld om IF-eiwitten uit cellen en weefsels te isoleren, te scheiden en te reconstrueren, in het algemeen met lage en...

<html> IF&#39;s zijn een familie van eiwitten die bij mensen worden gecodeerd door 73 genen en zijn ingedeeld in zes hoofdvormen: typen I-IV zijn cytoplasmatisch ( bijv. Epitheliale en haarkeratinen (K), myocyt desmin, neurofilamenten, glialfibrillair zuur eiwit (GFAP), en anderen); Type V zijn de kernlamellen; En type VI zijn IF&#39;s in de ooglens 1 . In termen van hun moleculaire organisatie hebben IF-eiwitten drie gemeenschappelijke domeinen: een hoogwaardig geconsolideerd &quot;spiraal&quot; -domein, en bolvormige &quot;hoofd- en&quot; staartdomeinen. Als eiwittetrameren elkaar samenvoegen om korte filamentprecursoren te vormen, die uiteindelijk worden opgenomen in volwassen filamenten die dynamische cytoskeletale en nucleoskeletale structuren vormen die betrokken zijn bij mechanische bescherming 2 , stresswaarneming 3 , 4 , regulatie van transcriptie 5 en groei en andere kritische cellulaire functies&quot;&gt; 1 , 6 , 7 . Het functionele belang van het IF-systeem wordt gemarkeerd door het bestaan ​​van vele menselijke ziekten veroorzaakt door missense-mutaties in IF-genen, waaronder neuropathieën, myopathieën, huidverstoringsstoornissen, metabolische disfuncties en vroegtijdige verouderende syndromen 8 . Sommige IF-genmutaties veroorzaken niet, maar veronderstellen hun dragers op ziekteprogressie, zoals de eenvoudige epitheliale keratinen bij de leverziekte 9 . Deze laatste is te danken aan de kritische stress-beschermende functies van IF&#39;s in epithelia. IF&#39;s in het algemeen behoren tot de meest voorkomende cellulaire eiwitten onder basale condities, maar worden verder sterk geïnduceerd tijdens verschillende soorten stress 10 . Bijvoorbeeld, recente studies die de eiwitbreedse veranderingen in de nematode C. elegans hebben aangetoond, aangetoond dat meerdere IF&#39;s sterk geherreguleerd en gevoelig zijn voor aggregatieAan tijdens organismeveroudering 11 , 12 . Aangezien het behoud van een juiste IF-structuur essentieel is voor cellulaire resistentie tegen verschillende vormen van stress 10 , kan IF aggregatie ook bijdragen aan de functionele daling tijdens veroudering. Echter, organismen op het niveau van studies die meerdere zoogdier IF-eiwitten onderzoeken over verschillende weefsels die stress ondervinden, ontbreken. IF&#39;s zijn zeer dynamische structuren die zich aanpassen aan mobiele eisen. Keratinen ondergaan bijvoorbeeld een biosynthese-onafhankelijke cyclus tussen oplosbaar (niet-filamente) en onoplosbaar (filamentvormig) eiwitpool 13 . Bij normale fysiologische omstandigheden kan ongeveer 5% het totale K8 / K18-pool worden geëxtraheerd in detergentvrije buffer, in vergelijking met ongeveer 20% die kan worden opgelost in het nonionische wasmiddel Nonidet P-40, dat biochemisch vergelijkbaar is met Triton- X100 14 , </sUp&gt; 15 . Tijdens mitose is er een opmerkelijke toename van de oplosbaarheid van enkel-type epitheel K8 en K1814, die minder zichtbaar is in epidermale keratinen, maar meer duidelijk in vimentine en andere type III IF-eiwitten 15 , 16 . Oplosbaarheidseigenschappen van IF-eiwitten worden strikt gereguleerd door fosforylering, een sleutel post-translationele modificatie (PTM) voor filamentherrangschikking en oplosbaarheid 17 , 18 , 19 , 20 . De meeste IF&#39;s ondergaan uitgebreide regelgeving door een aantal PTM&#39;s op geconserveerde locaties, wat resulteert in functionele veranderingen 17 . Het doel van deze methode is om onderzoekers te introduceren die nieuw zijn op het IF-gebied naar biochemische extractie en analytische methoden voor de studie van IF-eiwitten over meerdere muisweefsels. SpecifiekBondgenoot, concentreren we ons op isolatie van IF-eiwitten door gebruik te maken van een extractiemethode met hoge zout en beoordeling van veranderingen in PTM&#39;s via massaspectrometrie en door PTM-targetende antilichamen. Deze werkwijzen zijn gebaseerd op eerder gepubliceerde procedures 21, maar omvatten wijzigingen voor het extraheren van verschillende IF-eiwitsoorten om gemeenschappelijk mechanisme voor regulering over de IF-familie te ontdekken. Bijvoorbeeld reguleert K8-acetylering bij een specifiek lysine-residu filamentorganisatie, terwijl hyperacetylatie K8-onoplosbaarheid en aggregaatvorming 22 bevordert. Recent recente wereldwijde proteomische profileringsstudies hebben bovendien aangetoond dat de meeste weefselspecifieke IF-eiwitten ook doelstellingen voor acetylering zijn en dat de meeste IF-acetyleringsplaatsen beperkt zijn tot het sterk geconserveerde staafdomein. Dit wijst op de noodzaak van methoden die geschikt zijn voor wereldwijde profilering van het IF-systeem. We introduceren ook een snelle methode om IF-eiwitten van meerdere weefsels te isoleren met behulp van geautomatiseerde homogenisatie in optiGematiseerde lysingsmatrix. De resulterende preparaten zijn geschikt voor stroomafwaartse PTM analyse via massaspectrometrie en andere methoden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10009</td>
			<td>immunoprecipitation beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>for buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink RNA mini kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12183018</td>
			<td>RNA extraction from tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink DNAse set</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12185010A</td>
			<td>on column DNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamag-2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>magnet for use with dynabeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelCode Blue Stain Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24592</td>
			<td>mass spectrometry-compatible gel stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td>for use in western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA reverse transcription kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4368813</td>
			<td>for use in gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proflex 3x32-well PCR System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4484073</td>
			<td>PCR system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF transfer membrane&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88520</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Up SYBR master mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A25778</td>
			<td>for qPCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM7020</td>
			<td>solution for tissue storage prior to RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex 4-20% Tris Glycine Gel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>Precast protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Keratin 8 antibody (TS1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA514428</td>
			<td>for western blot detection of K8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA511883</td>
			<td>for western blot detection of vimentin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Glycine Transfer Buffer (25X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC3675</td>
			<td>for wet transfer of protein gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SDS Sample Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>for preparing protein gel samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Glycine SDS Running Buffer (10X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC26755</td>
			<td>for running protein gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing beads - Matrix D</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116913100</td>
			<td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing beads - Matrix SS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116921100</td>
			<td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-LITE</td>
			<td>measurement of protein and nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>EQ03119</td>
			<td>Automated tissue homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intermediate filament proteins from multiple mouse tissues to study aging-associated post-translational modifications

Intermediaire filamenten (IF&#39;s), samen met actinfilamenten en microtubules, vormen het cytoskelet - een kritisch structureel element van elke cel. Normaal functioneren IF&#39;s leveren cellen met mechanische en spanningsbestendigheid, terwijl een dysfunctioneel IF-cytoskelet de cellulaire gezondheid compromiseert en met veel mensenziekten is geassocieerd. Post-translationele modificaties (PTM&#39;s) regelen de IF-dynamiek kritiek op fysiologische veranderingen en onder stressomstandigheden. Daarom kan het vermogen om veranderingen in de PTM-handtekening van IF&#39;s te volgen, bijdragen aan een beter functioneel begrip en uiteindelijk conditioneren van het IF-systeem als een stressrespons tijdens cellulaire verwondingen. Het grote aantal IF-eiwitten, die door meer dan 70 individuele genen worden gecodeerd en op weefselafhankelijke wijze worden uitgedrukt, is echter een grote uitdaging om het relatieve belang van verschillende PTM&#39;s te sorteren. Daartoe zijn methoden die de controle op PTM&#39;s op IF-eiwitten mogelijk makenOp organisme-breed niveau, in plaats van voor geïsoleerde leden van de familie, kan de vooruitgang op het gebied van onderzoek op dit gebied versnellen. Hier presenteren we biochemische methoden voor het isoleren van de totale, detergensoplosbare en detergensbestendige fractie van IF-eiwitten uit 9 verschillende muisweefsels (hersenen, hart, long, lever, dunne darm, dikke darm, pancreas, nier en milt). We tonen verder een geoptimaliseerd protocol voor snelle isolatie van IF-eiwitten door gebruik te maken van lysende matrix en geautomatiseerde homogenisatie van verschillende muisweefsels. Het geautomatiseerde protocol is nuttig voor het profileren van IF&#39;s in experimenten met een hoog monstervolume (zoals bij ziektemodellen waarbij meerdere dieren en experimentele groepen betrokken zijn). De resulterende monsters kunnen worden gebruikt voor verschillende downstream analyses, met inbegrip van massaspectrometrie-gebaseerde PTM profilering. Met behulp van deze methoden geven wij nieuwe gegevens aan om te tonen dat IF-eiwitten in verschillende muizenweefsels (hersenen en leveren) parallelle veranderingen ondergaan met betrekking tot hun expressiesZioniveaus en PTM&#39;s tijdens veroudering.

Een nieuwe snelle methode voor het op hoge zout gebaseerde extractie van IF-eiwitten uit meerdere muisweefsels met behulp van lyseringsmatrix. De traditionele methode 25 , 26 van het isoleren van het grootste deel van de tussenliggende filament eiwitfractie uit epitheliaal weefsel werd hier gewijzigd om 9 verschil...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications at JoVE.com

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

In deze methode presenteren wij biochemische procedures voor snelle en efficiënte isolatie van intermediaire filament (IF) eiwitten uit meerdere muisweefsels. Geïsoleerde IF&#39;s kunnen worden gebruikt om veranderingen te onderzoeken in post-translatie modificaties door massaspectrometrie en andere biochemische analyses.

Isolatie van intermediaire filamentproteïnen uit meerdere muisweefsels om te bestuderen veroudering-geassocieerde post-translationele modificaties

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

Een methode voor het meten van RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Wijzigingen in cellen en weefsels

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Nucleaire magnetische resonantie spectroscopie voor de identificatie van verschillende fosforyleringen van intrinsiek ontvouwen eiwitten

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Met behulp van een uitgebreide Immunoprecipitation verrijking systeem ter identificatie van het profiel van een endogene posttranslationele wijziging voor Target eiwitten

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolatie van de Glomeruli en In Vivo Labeling van glomerulaire cel oppervlakte-eiwitten

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Naar buiten kijken: isolatie van Cyanobacteriële vrijgekomen Koolhydraatpolymeren en eiwitten

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Profilering van Ubiquitin en Ubiquitin-achtige afhankelijke post-translationele modificaties en identificatie van belangrijke veranderingen

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Dwarsdoorsnede van rijpe rijst(Oryza sativa L.) Kernels voor scanning elektronenmicroscopie beeldvorming met behulp van pipet tips als immobilisatie ondersteuning

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

Zuivering van tubuline met gecontroleerde posttranslationele modificaties en isotypes uit beperkte bronnen door polymerisatie-depolymerisatiecycli

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Zuivering van ubiquitinated p53-eiwitten uit zoogdiercellen

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Neutronenspectroscopie met hoge resolutie om picoseconde-nanosecondedynamiek van eiwitten en hydratatiewater te bestuderen

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...