Name: isolation of intermediate filament proteins from multiple mouse tissues to study aging-associated post-translational modifications
Uploaded: 2017-05-18T13:00:00
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Ce travail a été soutenu par le NIH octroie au NI R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] et P30 DK034987 [à UNC-Chapel Hill]. Les auteurs remercient Deekshita Ramanarayanan pour l&#39;assistance avec les expériences qPCR et Western Blot.

Le protocole est approuvé et exécuté conformément au Comité institutionnel pour les soins et l&#39;utilisation des animaux (IACUC) à l&#39;Université de Caroline du Nord. 1. Préparations <ol><li> Préparer le tampon Triton-X (1% de Triton X-100, 5 mM d&#39;acide éthylènediaminetétracétique (EDTA), augmenter le volume dans une solution salée tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4). Pour faire 500 ml: agiter 5 ml chacun de Triton X-100 et 500 mM d&#39;EDTA dans 490 ml de PBS, pH 7,4. Conserver la sol...

Les méthodes qui permettent la caractérisation biochimique des protéines IF peuvent être utiles pour comprendre de nombreux phénomènes pathophysiologiques dans les systèmes de mammifères, car les protéines IF sont à la fois des marqueurs et des modulateurs du stress cellulaire et tissulaire 29 . Le principe de la méthode actuelle repose sur les procédures initiales développées dans les années 1970 et 1980 pour isoler, séparer et reconstituer les protéines IF des cellules et des t...

<html> Les IF sont une famille de protéines qui, chez l&#39;homme, sont codées par 73 gènes et classées en six types majeurs: les types I-IV sont cytoplasmiques ( par exemple, les kératines épithéliales et capillaires (K), les desmin de myocytes, les neurofilaments, la protéine acide fibrillaire glieuse (GFAP) et d&#39;autres); Type V sont les laminés nucléaires; Et le type VI sont des IF dans l&#39;objectif 1 . En ce qui concerne leur organisation moléculaire, les protéines IF possèdent trois domaines communs: un domaine de &quot;tige&quot; à bobine enroulée hautement conservé et des domaines globulaires de &quot;tête&quot; et &quot;queue&quot;. Les tétrastes de protéines IF se forment pour former des précurseurs de filaments courts, qui sont finalement incorporés dans des filaments matures qui forment des structures cytosquelettiques et nucléosquelettes dynamiques impliquées dans la protection mécanique 2 , la détection du stress 3 , 4 , la régulation de la transcription 5 et la croissance et d&#39;autres fonctions cellulaires critiques&quot;&gt; 1 , 6 , 7 . L&#39;importance fonctionnelle du système IF est soulignée par l&#39;existence de nombreuses maladies humaines causées par des mutations missense dans les gènes IF, y compris les neuropathies, les myopathies, les troubles de la fragilité de la peau, les dysfonctionnements métaboliques et les syndromes de vieillissement prématuré 8 . Certaines mutations du gène IF ne causent pas, mais prédisposent leurs porteurs à la progression de la maladie, comme les kératines épithéliales simples dans la maladie du foie 9 . Ce dernier est dû aux fonctions critiques de protection contre le stress des IF dans les épithéliums. Les IF en général sont parmi les protéines cellulaires les plus abondantes dans des conditions basales, mais sont encore fortement induites lors de divers types de stress 10 . Par exemple, des études récentes évaluant les changements à l&#39;échelle du protéome dans le nématode C. elegans ont démontré que les IF multiples sont très régulées et enclines à l&#39;agrégatPendant le vieillissement organique 11 , 12 . Étant donné que la maintenance d&#39;une structure IF appropriée est essentielle pour la résistance cellulaire à diverses formes de stress 10 , l&#39;agrégation FI peut également contribuer au déclin fonctionnel pendant le vieillissement. Cependant, des études au niveau de l&#39;organisme examinant de multiples protéines IF de mammifères à travers différents tissus soumis au stress sont insuffisantes. Les IF sont des structures hautement dynamiques qui s&#39;adaptent aux besoins des cellulaires. Les kératines, par exemple, subissent un cyclisme indépendant de la biosynthèse entre un groupe protéique soluble (non filamenteux) et insoluble (filamentaire) 13 . Dans des conditions physiologiques normales environ 5%, le pool K8 / K18 total peut être extrait dans un tampon sans détergent, par rapport à environ 20% qui peut être solubilisé dans le détergent non ionique Nonidet P-40, qui est biochimiquement comparable à Triton- X100 14 , </sUp&gt; 15 . Au cours de la mitose, il y a une augmentation notable de la solubilité de l&#39;épithéliale de type simple K8 et K18 14 , qui est moins apparente dans les kératines épidermiques mais plus apparente dans la vimentine et d&#39;autres protéines IF de type III 15 , 16 . Les propriétés de solubilité des protéines IF sont étroitement réglementées par la phosphorylation, une modification clé après la traduction (PTM) pour le réarrangement des filaments et la solubilité 17 , 18 , 19 , 20 . La plupart des IF sont soumises à une réglementation étendue par un certain nombre de PTM sur des sites conservés, ce qui entraîne des changements fonctionnels 17 . Le but de cette méthode est d&#39;introduire des chercheurs qui sont nouveaux dans le champ IF pour l&#39;extraction biochimique et les méthodes analytiques pour l&#39;étude des protéines IF à travers de multiples tissus de souris. SpécifiqueNous nous concentrons sur l&#39;isolement des protéines IF en utilisant une méthode d&#39;extraction à haute teneur en sel et une évaluation des changements dans les PTM par spectrométrie de masse et par des anticorps ciblant PTM. Ces méthodes s&#39;appuient sur les procédures précédemment publiées 21, mais incluent des modifications pour extraire différents types de protéines IF pour révéler un mécanisme commun de régulation dans la famille IF. Par exemple, l&#39;acétylation de K8 à un résidu de lysine spécifique régule l&#39;organisation du filament, tandis que l&#39;hyperacétylation favorise l&#39;insolubilité du K8 et la formation d&#39;agrégats 22 . Des études récentes sur le profil protéomique mondial ont en outre révélé que la plupart des protéines IF spécifiques des tissus sont également des cibles pour l&#39;acétylation et que la plupart des sites d&#39;acétylation IF sont confinés au domaine de la tige très conservé. Cela souligne la nécessité de méthodes adaptées au profilage global du système IF. Nous introduisons également une méthode rapide d&#39;isolement des protéines IF à partir de tissus multiples en utilisant une homogénéisation automatique en optiMatrice de lysisation. Les préparations résultantes sont appropriées pour l&#39;analyse PTM en aval par spectrométrie de masse et d&#39;autres méthodes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10009</td>
			<td>immunoprecipitation beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>for buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink RNA mini kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12183018</td>
			<td>RNA extraction from tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink DNAse set</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12185010A</td>
			<td>on column DNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamag-2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>magnet for use with dynabeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelCode Blue Stain Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24592</td>
			<td>mass spectrometry-compatible gel stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td>for use in western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA reverse transcription kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4368813</td>
			<td>for use in gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proflex 3x32-well PCR System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4484073</td>
			<td>PCR system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF transfer membrane&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88520</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Up SYBR master mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A25778</td>
			<td>for qPCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM7020</td>
			<td>solution for tissue storage prior to RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex 4-20% Tris Glycine Gel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>Precast protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Keratin 8 antibody (TS1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA514428</td>
			<td>for western blot detection of K8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA511883</td>
			<td>for western blot detection of vimentin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Glycine Transfer Buffer (25X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC3675</td>
			<td>for wet transfer of protein gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SDS Sample Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>for preparing protein gel samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Glycine SDS Running Buffer (10X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC26755</td>
			<td>for running protein gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing beads - Matrix D</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116913100</td>
			<td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing beads - Matrix SS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116921100</td>
			<td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-LITE</td>
			<td>measurement of protein and nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>EQ03119</td>
			<td>Automated tissue homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intermediate filament proteins from multiple mouse tissues to study aging-associated post-translational modifications

Les filaments intermédiaires (IF), ainsi que les filaments d&#39;actine et les microtubules, forment le cytosquelette - un élément structurel critique de chaque cellule. Les mécanismes de fonctionnement normal fournissent aux cellules une résilience mécanique et résistante au stress, tandis qu&#39;un cytosquelette SF dysfonctionnel compromet la santé cellulaire et a été associé à de nombreuses maladies humaines. Les modifications post-traductionnelles (PTM) régulent de manière critique la dynamique de l&#39;IF en réponse aux changements physiologiques et aux conditions de stress. Par conséquent, la capacité de surveiller les changements dans la signature PTM des IF peut contribuer à une meilleure compréhension fonctionnelle et, en fin de compte, le conditionnement du système IF en tant que résonateur de stress pendant les lésions cellulaires. Cependant, le grand nombre de protéines IF, codées par plus de 70 gènes individuels et exprimés de manière dépendant des tissus, est un défi majeur pour trier l&#39;importance relative des PTM différents. À cette fin, des méthodes permettant la surveillance des PTM sur les protéines IFÀ l&#39;échelle de l&#39;organisme, plutôt que pour les membres isolés de la famille, peut accélérer les progrès de la recherche dans ce domaine. Ici, nous présentons des méthodes biochimiques pour l&#39;isolement de la fraction totale, détergente-soluble et détergente des protéines IF de 9 différents tissus de souris (cerveau, coeur, poumon, foie, intestin grêle, intestin grêle, pancréas, rein et rate). Nous démontrons en outre un protocole optimisé pour l&#39;isolement rapide des protéines IF en utilisant la matrice de lysage et l&#39;homogénéisation automatisée de différents tissus de souris. Le protocole automatisé est utile pour le profilage des IF dans des expériences avec un volume élevé d&#39;échantillons (comme dans les modèles de maladies impliquant plusieurs animaux et des groupes expérimentaux). Les échantillons résultants peuvent être utilisés pour diverses analyses en aval, y compris le profil PTM à base de spectrométrie de masse. En utilisant ces méthodes, nous fournissons de nouvelles données pour montrer que les protéines IF dans différents tissus de souris (cerveau et foie) subissent des changements parallèles par rapport à leur expressionLes niveaux de tension et les PTM pendant le vieillissement.

Une nouvelle méthode rapide pour l&#39;extraction à haute teneur en sel de protéines IF à partir de tissus de souris multiples utilisant une matrice de lysisation. La méthode traditionnelle 25 , 26 d&#39;isolement de la fraction de protéine de filament intermédiaire du tissu épithélial a été modifiée i...

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Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Dans cette méthode, nous présentons des procédures biochimiques pour l&#39;isolement rapide et efficace des protéines de filament intermédiaire (IF) provenant de multiples tissus de souris. Les IF isolés peuvent être utilisés pour étudier les changements dans les modifications post-traductionnelles par spectrométrie de masse et d&#39;autres analyses biochimiques.

Isolation des protéines de filament intermédiaires à partir de tissus de souris multiples pour étudier les modifications post-traductionnelles associées au vieillissement

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Recherche

Biochimie

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