Name: isolation of intermediate filament proteins from multiple mouse tissues to study aging-associated post-translational modifications
Uploaded: 2017-05-18T13:00:00
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Diese Arbeit wurde von den NIH-Stipendien NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] und P30 DK034987 [an UNC-Chapel Hill] unterstützt. Die Autoren danken Deekshita Ramanarayanan für Unterstützung bei qPCR und Western-Blot-Experimenten.

Das Protokoll wird gemäß dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of North Carolina genehmigt und durchgeführt. 1. Vorbereitungen <ol><li> Triton-X-Puffer (1% Triton X-100, 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) vorbereiten, Volumen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4) aufbringen. Um 500 ml zu ergeben: 5 ml Triton X-100 und 500 mM EDTA in 490 ml PBS, pH 7,4, umrühren. Triton-X-Pufferlösung bei 4 ° C aufbewahren. </li><li> Vorbereitung des Salzsalzes (1...

Methoden, die die biochemische Charakterisierung von IF-Proteinen ermöglichen, können nützlich sein, um zahlreiche pathophysiologische Phänomene in Säugetiersystemen zu verstehen, da IF-Proteine ​​sowohl Marker als auch Modulatoren von Zell- und Gewebedressen sind 29 . Das Prinzip der aktuellen Methode basiert auf den in den 1970er und 1980er Jahren entwickelten Initialverfahren zur Isolierung, Trennung und Rekonstituierung von IF-Proteinen aus Zellen und Geweben, die in der Regel niedri...

<html> IFs sind eine Familie von Proteinen, die beim Menschen von 73 Genen kodiert und in sechs Haupttypen kategorisiert sind: Die Typen I-IV sind zytoplasmatisch ( zB Epithel- und Haarkeratine (K), Myozyten desmin, Neurofilamente, gliales fibrilläres saures Protein (GFAP), und andere); Typ V sind die nuklearen Lamine; Und Typ VI sind IFs in der Augenlinse 1 . In Bezug auf ihre molekulare organisation haben IF-Proteine ​​drei gemeinsame Domänen: eine hochkonservierte Coiled-Coil-&quot;Stab&quot; -Domäne und globuläre &quot;Head&quot; und &quot;tail&quot; Domains. Wenn Protein-Tetramere zusammengesetzt werden, um kurze Filamentvorläufer zu bilden, die letztlich in reife Filamente eingebaut werden, die dynamische zytoskeletale und nukleoskeletale Strukturen, die an mechanischem Schutz 2 , Stress-Sensing 3 , 4 , Regulierung der Transkription 5 und Wachstum und anderen kritischen zellulären Funktionen beteiligt sind,&quot;&gt; 1 , 6 , 7 . Die funktionelle Bedeutung des IF-Systems wird durch die Existenz vieler menschlicher Erkrankungen hervorgerufen, die durch Missense-Mutationen in IF-Genen verursacht werden, einschließlich Neuropathien, Myopathien, Hautzerstörungsstörungen, metabolische Dysfunktionen und vorzeitige Alterungssyndrome 8 . Einige IF-Gen-Mutationen verursachen nicht, sondern prädisponieren ihre Träger zur Krankheitsprogression, wie die einfachen epithelialen Keratine in der Lebererkrankung 9 . Letzteres ist auf die kritischen Stress-Schutzfunktionen von IFs in Epithelien zurückzuführen. IFs gehören im Allgemeinen zu den am häufigsten vorkommenden zellulären Proteinen unter basalen Bedingungen, sind aber bei verschiedenen Belastungsarten weiter stark induziert 10 . Zum Beispiel haben neuere Studien, die proteomweite Veränderungen im Nematoden C. elegans untersuchten, gezeigt, dass mehrere IFs hoch hochreguliert und anfällig für Aggregat sindWährend der organisatorischen Alterung 11 , 12 . Da die Aufrechterhaltung einer geeigneten IF-Struktur für die zelluläre Resistenz gegenüber verschiedenen Formen von Stress 10 wesentlich ist, kann die IF-Aggregation auch bei der Alterung zum funktionellen Rückgang beitragen. Allerdings fehlt es an organismalen Studien, die mehrere Säugetier-IF-Proteine ​​über verschiedene Gewebe untersuchen, die sich einer Belastung unterziehen. IFs sind hochdynamische Strukturen, die sich an zellulare Anforderungen anpassen. Keratine werden beispielsweise einem biosyntheseunabhängigen Zyklus zwischen löslichem (nicht filamentösem) und unlöslichem (filamentösen) Protein-Pool 13 unterzogen. Unter normalen physiologischen Bedingungen kann etwa 5% der gesamte K8 / K18-Pool in reinigungsmittelfreiem Puffer extrahiert werden, im Vergleich zu etwa 20%, der im nichtionischen Detergens Nonidet P-40 solubilisiert werden kann, das biochemisch mit Triton- X100 14 , </sUp&gt; 15 Während der Mitose gibt es eine bemerkenswerte Erhöhung der Löslichkeit von einfachem Epithel K8 und K18 14 , was bei epidermalen Keratinen weniger offensichtlich ist, aber deutlicher in Vimentin und anderen Typ III IF-Proteinen 15 , 16 ist . Die Löslichkeitseigenschaften von IF-Proteinen werden durch Phosphorylierung, eine Schlüssel-posttranslationale Modifikation (PTM) für die Fadenumlagerung und Löslichkeit 17 , 18 , 19 , 20 , geregelt. Die meisten IFs unterliegen einer umfangreichen Regulierung durch eine Reihe von PTMs an konservierten Standorten, was zu funktionalen Veränderungen führt. Der Zweck dieser Methode ist es, Ermittler einzuführen, die neu im IF-Feld sind, um biochemische Extraktion und analytische Methoden für die Untersuchung von IF-Proteinen über mehrere Maus-Gewebe. SpezifischWir konzentrieren uns auf die Isolierung von IF-Proteinen unter Verwendung einer Hochsalz-Extraktionsmethode und Bewertung von Veränderungen in PTMs durch Massenspektrometrie und durch PTM-Targeting-Antikörper. Diese Methoden bauen auf den zuvor veröffentlichten Prozeduren 21 auf , umfassen jedoch Modifikationen zum Extrahieren verschiedener IF-Protein-Typen, um einen gemeinsamen Mechanismus für die Regulierung über die IF-Familie aufzudecken. Beispielsweise reguliert die K8-Acetylierung an einem spezifischen Lysinrest die Filamentorganisation, während die Hyperacetylierung die K8-Unlöslichkeit und die Aggregatbildung 22 fördert. Jüngste globale Proteom-Profiling-Studien haben zusätzlich gezeigt, dass die meisten gewebespezifischen IF-Proteine ​​auch Ziele für die Acetylierung sind und dass die meisten IF-Acetylierungsstellen auf die hoch konservierte Stab-Domäne beschränkt sind. Dies unterstreicht die Notwendigkeit von Methoden, die für die globale Profilierung des IF-Systems geeignet sind. Wir führen auch eine schnelle Methode zur Isolierung von IF-Proteinen aus mehreren Geweben mit automatisierter Homogenisierung in opti einGemischte lysing matrix Die resultierenden Präparate eignen sich für die nachgeschaltete PTM-Analyse über Massenspektrometrie und andere Methoden.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10009</td>
			<td>immunoprecipitation beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>for buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink RNA mini kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12183018</td>
			<td>RNA extraction from tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink DNAse set</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12185010A</td>
			<td>on column DNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamag-2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>magnet for use with dynabeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelCode Blue Stain Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24592</td>
			<td>mass spectrometry-compatible gel stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td>for use in western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA reverse transcription kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4368813</td>
			<td>for use in gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proflex 3x32-well PCR System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4484073</td>
			<td>PCR system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF transfer membrane&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88520</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Up SYBR master mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A25778</td>
			<td>for qPCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM7020</td>
			<td>solution for tissue storage prior to RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex 4-20% Tris Glycine Gel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>Precast protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Keratin 8 antibody (TS1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA514428</td>
			<td>for western blot detection of K8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA511883</td>
			<td>for western blot detection of vimentin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Glycine Transfer Buffer (25X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC3675</td>
			<td>for wet transfer of protein gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SDS Sample Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>for preparing protein gel samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Glycine SDS Running Buffer (10X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC26755</td>
			<td>for running protein gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing beads - Matrix D</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116913100</td>
			<td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing beads - Matrix SS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116921100</td>
			<td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-LITE</td>
			<td>measurement of protein and nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>EQ03119</td>
			<td>Automated tissue homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intermediate filament proteins from multiple mouse tissues to study aging-associated post-translational modifications

Zwischenfilamente (IFs) bilden zusammen mit Aktinfilamenten und Mikrotubuli das Zytoskelett - ein kritisches Strukturelement jeder Zelle. Normal funktionierende IFs liefern Zellen mit mechanischer und Belastungsstabilität, während ein dysfunktionelles IF-Zytoskelett die zelluläre Gesundheit beeinträchtigt und mit vielen menschlichen Krankheiten assoziiert wurde. Posttranslationale Modifikationen (PTMs) kritisieren die IF-Dynamik kritisch als Reaktion auf physiologische Veränderungen und unter Stressbedingungen. Daher kann die Fähigkeit, Änderungen in der PTM-Signatur von IFs zu überwachen, zu einem besseren funktionalen Verständnis und letztlich Konditionierung des IF-Systems als Stress-Responder bei zellulären Verletzungen beitragen. Allerdings ist die große Anzahl von IF-Proteinen, die von über 70 einzelnen Genen codiert und gewebeabhängig ausgedrückt werden, eine große Herausforderung, die relative Bedeutung verschiedener PTMs zu lokalisieren. Zu diesem Zweck werden Methoden, die die Überwachung von PTMs auf IF-Proteinen ermöglichenAuf einer organismusweiten Ebene, anstatt für isolierte Familienmitglieder, kann den Forschungsfortschritt in diesem Bereich beschleunigen. Hier präsentieren wir biochemische Methoden zur Isolierung der gesamten, detergenzlöslichen und detergenzresistenten Fraktion von IF-Proteinen aus 9 verschiedenen Mausgeweben (Gehirn, Herz, Lunge, Leber, Dünndarm, Dickdarm, Bauchspeicheldrüse, Niere und Milz). Wir zeigen weiterhin ein optimiertes Protokoll zur schnellen Isolierung von IF-Proteinen unter Verwendung von Lysing-Matrix und automatisierter Homogenisierung verschiedener Mausgewebe. Das automatisierte Protokoll ist nützlich für die Profilierung von IFs in Experimenten mit hohem Probenvolumen (wie bei Krankheitsmodellen mit mehreren Tieren und experimentellen Gruppen). Die resultierenden Proben können für verschiedene nachgeschaltete Analysen verwendet werden, einschließlich massenspektrometrischer PTM-Profilierung. Unter Verwendung dieser Methoden liefern wir neue Daten, um zu zeigen, dass IF-Proteine ​​in verschiedenen Mausgeweben (Gehirn und Leber) parallele Veränderungen in Bezug auf ihre Expres unterliegenUnd PTMs während des Alterns.

Eine neue Schnellmethode für die hochsalzbasierte Extraktion von IF-Proteinen aus mehreren Mausgeweben mittels Lysing-Matrix. Die traditionelle Methode 25 , 26 der Isolierung der Masse der Zwischenfilamentproteinfraktion aus Epithelgewebe wurde hier modifiziert, um 9 verschiedene Organe und ein schnelleres Verfah...

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Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

In diesem Verfahren stellen wir biochemische Verfahren zur schnellen und effizienten Isolierung von Zwischenfilament (IF) Proteinen aus mehreren Mausgeweben vor. Isolierte IFs können verwendet werden, um Veränderungen in posttranslationalen Modifikationen durch Massenspektrometrie und andere biochemische Assays zu untersuchen.

Isolierung von Zwischenfilamentproteinen aus mehreren Mausgeweben zur Untersuchung von altern-assoziierten posttranslationalen Modifikationen

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

Verfahren zum Messen von RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Änderungen in Zellen und Geweben

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Forschung

Biochemie

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Kernresonanzspektroskopie zur Identifizierung von Multiple Phosphorylierungen von intrinsisch ungeordneten Proteinen

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Nutzung eines umfassenden Immunopräzipitation Bereicherung System um eine endogene Post-translationale Modifikation Profil für Zielproteine zu identifizieren

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolierung der Glomeruli und In Vivo Kennzeichnung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Blick nach außen: Isolierung von cyanobakteriellen freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und Proteinen

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Profilierung von Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen abhängigen posttranslationalen Änderungen und Identifizierung signifikanter Änderungen

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Querschnitt von reifem Reis (Oryza sativa L.) Kerne für die Rasterelektronenmikroskopie-Bildgebung mit Pipettenspitzen als Immobilisierungsunterstützung

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

Reinigung von Tubulin mit kontrollierten posttranslationalen Modifikationen und Isotypen aus begrenzten Quellen durch Polymerisations-Depolymerisationszyklen

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Aufreinigung ubiquitinierter p53-Proteine aus Säugetierzellen

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Hochauflösende Neutronenspektroskopie zur Untersuchung der Pikosekunden-Nanosekunden-Dynamik von Proteinen und Hydratationswasser

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...