Name: isolation of intermediate filament proteins from multiple mouse tissues to study aging-associated post-translational modifications
Uploaded: 2017-05-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי NIH מעניקה NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS], ו P30 DK034987 [ל UNC- קפלה היל]. המחברים מודים Deekshita Ramanarayanan לעזרה עם qPCR וניסוי כתם המערבי.

הפרוטוקול מאושר ומבוצע על פי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדת (IACUC) באוניברסיטת צפון קרוליינה. 1. הכנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ טריטון- X (1% Triton X-100, 5 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), להעלות את נפח פוספט שנאגרו מל?...

שיטות המאפשרות אפיון ביוכימי של חלבונים IF יכול להיות שימושי כדי להבין תופעות פתופיזיולוגיות רבות במערכות יונקים, שכן אם חלבונים הם גם סמנים מאפננים של מתח הסלולר והרקמה 29 . העיקרון שמאחורי השיטה הנוכחית מבוסס על ההליכים הראשונים שפותחו בשנות השבעים והש...

<html> IFs הם משפחה של חלבונים שבני אדם מקודדים על ידי 73 גנים ומסווגים לשישה סוגים עיקריים: סוגים I-IV הם cytoplasmic ( כגון אפיתל וקראטינים של שיער (K), דגימת מיוציטים, נוירופילמנטים, חלבון חומצי פיבריללי גלילי (GFAP) ואחרים); סוג V הם lamins גרעיני; וסוג VI הם IFs בעדשת העין 1 . מבחינת האבולוציה המולקולרית שלהם, אם לחלבונים יש שלושה תחומים נפוצים: תחום משוכלל של מוט &quot;סליל&quot;, ותחום &quot;ראש&quot; ו&quot;זנב &quot;גלובלי. אם tetramers חלבון להרכיב טופס מבשרי קצר, אשר משולבים בסופו של דבר לתוך חוטים בוגרים כי מבנה מבנים cytoskeletal דינמי מבנים נוקלאוסקלטליים המעורבים בהגנה מכנית 2 , מתח חישה 3 , 4 , תקנה של שעתוק 5 וצמיחה, פונקציות חיוניות אחרות קריטי&quot;&gt; 1 , 6 , 7 . החשיבות הפונקציונלית של מערכת ה- IF מודגשת על ידי קיומו של מחלות אנושיות רבות הנגרמות על ידי מוטציות של גנים IF, כולל נוירופתיות, מיופתים, הפרעות בשבריריות העור, הפרעות בתפקוד מטבולי ותסמונות מוקדמות של הזדקנות מוקדמת. כמה מוטציות גן IF לא לגרום, אבל predispose נשאים שלהם התקדמות המחלה, כגון קרטין אפיתל פשוט מחלת כבד 9 . זה האחרון בשל הפונקציות הקריטיות להגנה על הלחץ של IFs באפיתליה. IFs באופן כללי הם בין חלבונים הסלולר שופע ביותר בתנאים הבסיסיים, אבל הם עוד יותר המושרה חזק במהלך סוגים שונים של מתח 10 . לדוגמה, מחקרים שנערכו לאחרונה מעריכים את השינויים ב- protea-wide ב- nematode C. elegans שהראו כי מספר רב של IFS הם בעלי רמה גבוהה ונוטים לצבורOn במהלך ההזדקנות האורגניזמים 11 , 12 . מאחר ותחזוקת מבנה IF תקין היא חיונית להתנגדות סלולרית לצורות שונות של לחץ 10 , אם הצבירה עשויה גם היא לתרום לירידה תפקודית במהלך ההזדקנות. עם זאת, מחקרים ברמת האורגניזמים בודקים מספר רב של יונקים חלבונים IF על פני רקמות שונות בלחץ הם חסרים. IFs הם מבנים דינמיים מאוד להסתגל כדי לענות על דרישות הסלולר. Keratins, למשל, עוברים רכיבה עצמאית ביוסינתזה בין בריכת חלבון מסיס (לא פילמנטית) ו מסיס (נימי) חלבון 13 . בתנאים פיזיולוגיים רגילים כ -5% ניתן להפיק את מאגר K8 / K18 הכולל במאגר ללא חומרי ניקוי, בהשוואה לכ -20% שניתן להסיסם בחומר הניקוי הלא יוניד Nonidet P-40, אשר ניתן להשוותו ביוכימית ל- Triton- X100 14 , </sלמעלה&gt; 15 . במהלך מיטוזה יש עלייה ניכרת את מסיסות של סוג פשוט אפיתל K8 ו K18 14 , אשר ניכרת פחות אפידרמיס keratins אבל נראה יותר ב vimentin ו III סוג אחר IF חלבונים 15 , 16 . תכונות מסיסות של חלבונים IF הם מוסדרים בחוזקה על ידי זרחון, שינוי שלאחר טרנסלוציאציה המפתח (PTM) עבור סידור נימה מסיסות 17 , 18 , 19 , 20 . רוב ה- IFs עוברים תקנה נרחבת על ידי מספר PTMs באתרים משומרים, וכתוצאה מכך שינויים פונקציונליים 17 . מטרת שיטה זו היא להציג חוקרים חדשים בתחום IF למיצוי ביוכימי ושיטות אנליטיות לחקר חלבונים אם על פני רקמות עכבר מרובות. ספֵּצִיפִי, אנו מתמקדים בבידוד של חלבונים IF באמצעות שיטת מיצוי מלח גבוהה והערכת שינויים ב- PTM באמצעות ספקטרומטריית מסה ועל-ידי נוגדנים המכוונים ל- PTM. שיטות אלה מבוססות על הליכים שפורסמו בעבר, אך כוללים שינויים לחילוץ סוגים שונים של חלבונים IF כדי לחשוף מנגנון נפוץ לרגולציה בכל רחבי המשפחה. לדוגמה, acetylation K8 ב שאריות ליזין מסוים מסדיר ארגון נימה, בעוד hyperacetylation מקדם K8 מסיסות ויצירת המצרפי 22 . מחקרים גלובליים חדשים proteomic Profiledic יש גם גילה כי רוב הרקמה ספציפית IF חלבונים גם מטרות acetylation וכי רוב אתרי acetylation IF מוגבלים לתחום מוט משומר מאוד. זה מדגיש את הצורך בשיטות המתאימות פרופיל גלובלית של מערכת IF. כמו כן, אנו מציגים שיטה מהירה של בידוד חלבונים IF מ רקמות מרובות באמצעות homogenization אוטומטי Optiמטריצה ​​lysing. ההכנות כתוצאה מתאימים לניתוח PTM במורד הזרם באמצעות ספקטרומטריית מסה ושיטות אחרות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10009</td>
			<td>immunoprecipitation beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>for buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink RNA mini kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12183018</td>
			<td>RNA extraction from tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink DNAse set</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12185010A</td>
			<td>on column DNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamag-2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>magnet for use with dynabeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelCode Blue Stain Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24592</td>
			<td>mass spectrometry-compatible gel stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td>for use in western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA reverse transcription kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4368813</td>
			<td>for use in gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proflex 3x32-well PCR System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4484073</td>
			<td>PCR system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF transfer membrane&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88520</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Up SYBR master mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A25778</td>
			<td>for qPCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM7020</td>
			<td>solution for tissue storage prior to RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex 4-20% Tris Glycine Gel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>Precast protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Keratin 8 antibody (TS1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA514428</td>
			<td>for western blot detection of K8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA511883</td>
			<td>for western blot detection of vimentin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Glycine Transfer Buffer (25X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC3675</td>
			<td>for wet transfer of protein gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SDS Sample Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>for preparing protein gel samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Glycine SDS Running Buffer (10X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC26755</td>
			<td>for running protein gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing beads - Matrix D</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116913100</td>
			<td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing beads - Matrix SS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116921100</td>
			<td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-LITE</td>
			<td>measurement of protein and nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>EQ03119</td>
			<td>Automated tissue homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intermediate filament proteins from multiple mouse tissues to study aging-associated post-translational modifications

סיבים בינוניים (IFs), יחד עם חוטים actin ו microtubules, טופס cytoskeleton - מרכיב מבניים קריטיים של כל תא. תפקוד תקין IFs מספקים תאים עם עמידות מכנית ומתח, בעוד cytoskeleton IF מתפקדת פשרות בריאות הסלולר כבר קשור עם מחלות אנושיות רבות. שינויים לאחר טרנספורמציה (PTM) מסדירים בצורה ביקורתית את הדינאמיקה של IF בתגובה לשינויים פיזיולוגיים ובתנאי לחץ. לכן, היכולת לפקח על השינויים בחתימת ה- PTM של IFs יכולה לתרום להבנה תפקודית טובה יותר, ובסופו של דבר מיזוג, של מערכת ה- IF כמגיב מתח במהלך פגיעה סלולרית. עם זאת, מספר גדול של חלבונים IF, אשר מקודדים על ידי יותר מ -70 גנים בודדים לידי ביטוי באופן תלוי רקמות, הוא אתגר גדול במיון את החשיבות היחסית של PTM שונים. לשם כך, שיטות המאפשרים ניטור של PTMs על חלבונים IFעל רמה אורגניזם רחב, ולא עבור בני משפחה מבודדים של המשפחה, יכול להאיץ את התקדמות המחקר בתחום זה. כאן, אנו מציגים שיטות ביוכימיות לבידוד של החלק הכולל, דטרגנט מסיסים, וחלק עמידים דטרגנט של חלבונים IF מ 9 רקמות עכבר שונות (המוח, הלב, הריאות, הכבד, המעי הדק, המעי הגס, הלבלב, הכליות, ו טְחוֹל). אנחנו עוד להדגים פרוטוקול אופטימיזציה לבידוד מהיר של חלבונים IF באמצעות מטריקס lysing ו homogenization אוטומטי של רקמות עכבר שונות. פרוטוקול אוטומטי שימושי עבור אפיון פרופילים IFS בניסויים עם נפח מדגם גבוה (כגון מודלים המחלה מעורבים בעלי חיים מרובים קבוצות ניסיוניות). הדגימות שנוצרו יכול להיות מנוצל עבור ניתוחים במורד שונים, כולל ספקטרומטריית מסה מבוססי ספקטרומטריית מסה. באמצעות שיטות אלה, אנו מספקים נתונים חדשים כדי להראות כי אם חלבונים ברקמות עכבר שונות (המוח והכבד) עוברים שינויים מקבילים לגבי expres שלהםSion רמות ו PTMs במהלך ההזדקנות.

שיטה חדשה מהירה עבור מיצוי מבוסס מלח גבוהה של חלבונים IF מ רקמות העכבר מרובים באמצעות מטריקס lysing. השיטה המסורתית 25 , 26 של בידוד חלק ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications at JoVE.com

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

בשיטה זו, אנו מציגים תהליכים ביוכימיים לבידוד מהיר ויעיל של חלבונים בינוניים (IF) חלבונים מרקמות עכבר מרובות. IFs מבודד ניתן להשתמש כדי ללמוד שינויים שינויים שלאחר translational ידי ספקטרומטריית מסה בדיקות ביוכימיים אחרים.

בידוד של חלבונים ביניים חלבונים מ רקמות עכבר מרובות לחקר ההזדקנות הקשורים שינויים טרנסלוציוניים

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

שיטה למדידת RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; שינויי -methyladenosine ב תאים ורקמות

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

ספקטרוסקופיה הגרעיני תהודה מגנטית עבור זיהוי של Phosphorylations המרובה של חלבונים לא תקינים מהותיים

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

ניצול מערכת העשרה Immunoprecipitation מקיף כדי לזהות פרופיל אנדוגני שינוי Post-translational של חלבונים היעד

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

בידוד של Glomeruli, In Vivo תיוג של חלבונים פני שטח התא Glomerular

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

מבט כלפי חוץ: בידוד של Cyanobacterial שוחרר פולימרים פחמימות וחלבונים

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

יצירת פרופיל אוביקוויפין ואוביקוויב-שינויים עצמאיים וזיהוי של שינויים משמעותיים

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

חתך רוחבי של אורז בוגר (Oryza sativa L.) גרעינים לסריקת הדמיית מיקרוסקופיה אלקטרונית באמצעות טיפים פיפטה כתמיכה ללא תנועה

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

טיהור טובולין עם שינויים מבוקרים לאחר טרנסלציה ואיזוטיפים ממקורות מוגבלים על ידי מחזורי פידול-דפולימריזציה

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

טיהור של חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום מתאי יונקים

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

ספקטרוסקופיית נייטרונים ברזולוציה גבוהה לחקר דינמיקה של פיקו-שנייה-ננו-שנייה של חלבונים ומי לחות

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...