Name: isolation of intermediate filament proteins from multiple mouse tissues to study aging-associated post-translational modifications
Uploaded: 2017-05-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal NIH concede NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] e P30 DK034987 [alla UNC-Chapel Hill]. Gli autori ringraziano Deekshita Ramanarayanan per l&#39;assistenza con qPCR e western blot experiments.

Il protocollo è approvato e svolto in conformità con il comitato istituzionale per la cura e l&#39;uso degli animali (IACUC) presso l&#39;Università della Carolina del Nord. 1. Preparativi <ol><li> Preparare il tampone Triton-X (1% Triton X-100, 5 mM di acido etilendiammina-tetraacetico (EDTA), portare il volume in soluzione salina fosfata (PBS), pH 7,4). Per ottenere 500 mL: mescolare 5 mL ciascuno di Triton X-100 e 500 mM EDTA in 490 mL di PBS, pH 7,4. Conservare la soluzione tampone Triton-X a 4 ° C. </...

I metodi che permettono la caratterizzazione biochimica delle proteine ​​IF possono essere utili per comprendere numerosi fenomeni patofisiologici nei sistemi mammiferi, in quanto le proteine ​​IF sono entrambi marcatori e modulatori dello stress cellulare e del tessuto 29 . Il principio dietro il metodo attuale si basa sulle procedure iniziali sviluppate negli anni &#39;70 e &#39;80 per isolare, separare e ricostituire proteine ​​IF dalle cellule e dai tessuti, generalmente impiegand...

<html> Gli IF sono una famiglia di proteine ​​che sono umane codificate da 73 geni e sono classificate in sei tipi principali: i tipi I-IV sono citoplasmatici ( ad esempio cheratine epiteliali e capelli (K), miocite desmin, neurofilamenti, proteina acido fibrillare gliale (GFAP) e altri); Tipo V sono i lamini nucleari; E il tipo VI sono IF nella lente di occhio 1 . In termini di organizzazione molecolare, le proteine ​​IF hanno tre domini comuni: un dominio &quot;rod&quot; a spirale a spirale altamente conservato e domini globali &quot;testa&quot; e &quot;tail&quot;. IF si assemblano per formare precursori di filamenti brevi, che vengono infine incorporati in filamenti maturi che formano strutture dinamiche citoscheletriche e nucleoscheletriche coinvolte nella protezione meccanica 2 , stress sensing 3 , 4 , regolazione della trascrizione 5 e crescita e altre funzioni cellulari critiche&quot;&gt; 1 , 6 , 7 . L&#39;importanza funzionale del sistema IF è evidenziata dall&#39;esistenza di molte malattie umane causate da mutazioni missense nei geni IF, comprese le neuropatie, le miopatie, i disturbi della fragilità cutanea, le disfunzioni metaboliche e le sindromi di invecchiamento precoce 8 . Alcune mutazioni del gene IF non causano, ma predispongono i loro carrier alla progressione della malattia, come le semplici keratine epiteliali nella malattia epatica 9 . Quest&#39;ultima è dovuta alle funzioni critiche di protezione dello stress di IF in epitelio. Le IF sono in genere tra le proteine ​​cellulari più abbondanti in condizioni basali, ma sono inoltre fortemente indotte durante vari tipi di stress 10 . Ad esempio, studi recenti che valutano le variazioni del proteome nel nematode C. elegans hanno dimostrato che IF multipli sono altamente regolati e soggetti ad aggregatiDurante l&#39;invecchiamento organico 11 , 12 . Poiché la manutenzione di una corretta struttura IF è essenziale per la resistenza cellulare a varie forme di stress 10 , l&#39;aggregazione IF può anche contribuire al declino funzionale durante l&#39;invecchiamento. Tuttavia, mancano gli studi sul livello organico che esaminano più proteine ​​di mammiferi IF nei diversi tessuti sottoposti a stress. Le IF sono strutture altamente dinamiche che si adattano per soddisfare le esigenze cellulari. Le cheratine, ad esempio, subiscono un ciclismo indipendente dalla biosintesi tra il pool solubile (non filamentoso) e quello insolubile (filamentoso) 13 . In normali condizioni fisiologiche, circa il 5%, la piscina totale K8 / K18 può essere estratta in tampone privo di detersivo, rispetto a circa il 20% che può essere solubilizzata nel detergente non ionico Nonidet P-40, biochimicamente paragonabile a Triton- X100 14 , </sUp&gt; 15 . Durante la mitosi c&#39;è un notevole aumento della solubilità dell&#39;epitelio di tipo semplice K8 e K18 14 , che è meno evidente nelle cheratine epidermiche ma più evidente in vimentin e in altre proteine ​​di tipo III IF 15 e 16 . Le proprietà di solubilità delle proteine ​​IF sono fortemente regolate dalla fosforilazione, una modifica post-traduzionale chiave (PTM) per il riarrangiamento del filamento e la solubilità 17 , 18 , 19 , 20 . La maggior parte degli IF sono sottoposti ad una vasta regolazione da parte di un certo numero di PTM nei siti conservati, con conseguenti modifiche funzionali 17 . Lo scopo di questo metodo è introdurre gli investigatori che sono nuovi al campo IF per l&#39;estrazione biochimica e metodi analitici per lo studio delle proteine ​​IF attraverso diversi tessuti del topo. SpecificaCi concentriamo sull&#39;isolamento delle proteine ​​IF usando un metodo di estrazione ad alto sale e la valutazione dei cambiamenti nei PTM tramite spettrometria di massa e da anticorpi di targeting PTM. Questi metodi si basano su procedure precedentemente pubblicate21 ma includono modifiche per estrarre diversi tipi di proteine ​​IF per scoprire il meccanismo comune per la regolazione nella famiglia IF. Ad esempio, l&#39;acetilazione K8 in un residuo di lisina specifico regola l&#39;organizzazione del filamento, mentre l&#39;iperacetilazione favorisce l&#39;insolubilità di K8 e la formazione di aggregati 22 . I recenti studi di profilom proteomici globali hanno inoltre evidenziato che la maggior parte delle proteine ​​IF del tessuto-specifico sono anche obiettivi per l&#39;acetilazione e che la maggior parte dei siti di acetilazione IF sono limitati al dominio asta altamente conservato. Ciò evidenzia la necessità di metodi adatti alla profilazione globale del sistema IF. Introduciamo anche un rapido metodo di isolamento delle proteine ​​IF dai tessuti multipli utilizzando l&#39;omogeneizzazione automatizzata in optiMatrice di lysazione. I preparati risultanti sono adatti per l&#39;analisi PTM a valle tramite spettrometria di massa e altri metodi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10009</td>
			<td>immunoprecipitation beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>for buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink RNA mini kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12183018</td>
			<td>RNA extraction from tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink DNAse set</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12185010A</td>
			<td>on column DNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamag-2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>magnet for use with dynabeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelCode Blue Stain Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24592</td>
			<td>mass spectrometry-compatible gel stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td>for use in western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA reverse transcription kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4368813</td>
			<td>for use in gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proflex 3x32-well PCR System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4484073</td>
			<td>PCR system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF transfer membrane&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88520</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Up SYBR master mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A25778</td>
			<td>for qPCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM7020</td>
			<td>solution for tissue storage prior to RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex 4-20% Tris Glycine Gel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>Precast protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Keratin 8 antibody (TS1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA514428</td>
			<td>for western blot detection of K8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA511883</td>
			<td>for western blot detection of vimentin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Glycine Transfer Buffer (25X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC3675</td>
			<td>for wet transfer of protein gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SDS Sample Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>for preparing protein gel samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Glycine SDS Running Buffer (10X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC26755</td>
			<td>for running protein gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing beads - Matrix D</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116913100</td>
			<td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing beads - Matrix SS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116921100</td>
			<td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-LITE</td>
			<td>measurement of protein and nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>EQ03119</td>
			<td>Automated tissue homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intermediate filament proteins from multiple mouse tissues to study aging-associated post-translational modifications

I filamenti intermedi (IFs), insieme ai filamenti e ai microtubuli attinici, formano il citoscheletro - elemento strutturale critico di ogni cellula. IFs funzionanti normalmente forniscono le cellule con meccaniche e resistenza allo stress, mentre un citoscheletro IF disfunzionale compromette la salute cellulare e è stato associato a molte malattie umane. Le modificazioni post-traduzionali (PTMs) regolano criticamente la dinamica IF in risposta a cambiamenti fisiologici e in condizioni di stress. Pertanto, la capacità di monitorare i cambiamenti nella firma PTM di IF può contribuire a una migliore comprensione funzionale e, in ultima analisi, del sistema IF come risposta responsabile dello stress durante le lesioni cellulari. Tuttavia, il gran numero di proteine ​​IF, codificate da più di 70 geni individuali e espresse in maniera dipendente dal tessuto, è una sfida importante nell&#39;eliminare l&#39;importanza relativa di diversi PTM. A tal fine, metodi che consentono il monitoraggio di PTM sulle proteine ​​IFSu un livello organizzativo, piuttosto che per i membri isolati della famiglia, può accelerare il progresso della ricerca in questo settore. Qui presentiamo metodi biochimici per l&#39;isolamento della frazione totale resistente al detergente e resistente ai detergenti delle proteine ​​IF da 9 diversi tessuti del topo (cervello, cuore, polmone, fegato, piccolo intestino, intestino, pancreas, rene e milza). Inoltre dimostriamo un protocollo ottimizzato per il rapido isolamento delle proteine ​​IF utilizzando la matrice di lysing e l&#39;omogeneizzazione automatizzata di diversi tessuti del topo. Il protocollo automatizzato è utile per profilare gli IF in esperimenti con un elevato volume di campioni (come ad esempio nei modelli di malattia che coinvolgono più animali e gruppi sperimentali). I campioni risultanti possono essere utilizzati per varie analisi a valle, tra cui la profilazione PTM basata sulla spettrometria di massa. Utilizzando questi metodi, forniamo nuovi dati per dimostrare che le proteine ​​IF nei diversi tessuti del topo (cervello e fegato) subiscono cambiamenti paralleli rispetto al loro espressoLivelli di sione e PTM durante l&#39;invecchiamento.

Un nuovo metodo rapido per l&#39;estrazione elevata di proteine ​​IF dai diversi tessuti del topo usando la matrice di lysazione. Il metodo tradizionale 25 , 26 di isolare la maggior parte della frazione proteica filamentosa intermedia dal tessuto epiteliale è stato modificato qui per includere 9 diversi orga...

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Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

In questo metodo, presentiamo procedure biochimiche per l&#39;isolamento rapido ed efficace delle proteine ​​del filamento intermedio (IF) dai tessuti multipli del topo. Gli IF isolati possono essere utilizzati per studiare i cambiamenti nelle modificazioni post-traslazionali mediante spettrometria di massa e altri dosaggi biochimici.

Isolamento di proteine ​​filamentose intermedie da tessuti multipli di topo per studiare modificazioni post-traduzionali associate all&#39;invecchiamento

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

Un metodo per l&#39;RNA di misura<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine modifiche di cellule e tessuti

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Ricerca

Biochimica

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It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

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Isolamento dei Glomeruli e In Vivo di etichettatura delle proteine di superficie delle cellule glomerulari

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Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

Isolamento di proteine ​​filamentose intermedie da tessuti multipli di topo per studiare modificazioni post-traduzionali associate all'invecchiamento

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