Name: isolation of intermediate filament proteins from multiple mouse tissues to study aging-associated post-translational modifications
Uploaded: 2017-05-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskuddene NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] og P30 DK034987 [til UNC-Chapel Hill]. Forfatterne takker Deekshita Ramanarayanan for hjelp med qPCR og western blot-eksperimenter.

Protokollen er godkjent og utført i samsvar med Institutt for dyrepleie og bruk (IACUC) ved University of North Carolina. 1. Forberedelser <ol><li> Klargjør Triton-X-buffer (1% Triton X-100, 5 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), oppsaml volum i fosfatbuffert saltvann (PBS), pH 7,4). For å gjøre 500 ml: rør 5 ml hver av Triton X-100 og 500 mM EDTA i 490 ml PBS, pH 7,4. Oppbevar Triton-X bufferløsning ved 4 ° C. </li><li> Fremstill høy saltbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 140 mM NaCl, 1,5 M KCl, 5 mM ED...

Metoder som muliggjør biokjemisk karakterisering av IF-proteiner kan være nyttige for å forstå mange patofysiologiske fenomener i pattedyrsystemer, siden IF-proteiner er både markører og modulatorer av cellulært og vevsstress 29 . Prinsippet bak den nåværende metoden er basert på de første prosedyrene utviklet på 1970- og 1980-tallet for å isolere, separere og rekonstruere IF-proteiner fra celler og vev, generelt ved bruk av lav- og høysaltløsninger og Triton-X100-vaskemiddel <sup ...

<html> IF er en familie av proteiner som er kodet av 73 gener og er kategorisert i seks hovedtyper: typene I-IV er cytoplasmatiske ( f.eks. Epitel- og hårkeratiner (K), myocyt desmin, nevrofilamenter, glialfibrillær surt protein (GFAP), og andre); Type V er kjernen laminer; Og type VI er IF i øyelinsen 1 . Når det gjelder deres molekylære organisasjon, har IF-proteiner tre vanlige domener: et høyt konsentrert coiled-coil &quot;rod&quot; -domene, og globulære &quot;head&quot; og &quot;tail&quot; -domener. HVIS proteinetetramerer samles for å danne korte filamentprekursorer, som til slutt er innarbeidet i modne filamenter som former dynamiske cytoskeletale og nukleoskeletale strukturer involvert i mekanisk beskyttelse 2 , spenningsregistrering 3 , 4 , regulering av transkripsjon 5 og vekst og andre kritiske cellulære funksjoner&quot;&gt; 1 , 6 , 7 . Den funksjonelle betydningen av IF-systemet er fremhevet av eksistensen av mange humane sykdommer forårsaket av missens-mutasjoner i IF-gener, inkludert nevropatier, myopatier, hudfrekvensforstyrrelser, metabolske dysfunksjoner og for tidlig aldringssyndrom 8 . Noen IF-genmutasjoner forårsaker ikke, men predisponerer deres bærere til sykdomsprogresjon, som for eksempel enkle epithelialkeratiner i leversykdom 9 . Sistnevnte skyldes de kritiske stressbeskyttende funksjonene til IF i epithelia. IFs generelt er blant de mest omfattende cellulære proteiner under basale forhold, men er ytterligere sterkt indusert under ulike typer stress 10 . For eksempel viste nylige studier som evaluerte proteom-brede endringer i nematoden C. elegans at flere IF er høyt oppregulert og tilbøyelig til aggregatPå under organisatorisk aldring 11 , 12 . Siden vedlikehold av en skikkelig IF-struktur er avgjørende for cellulær motstand mot forskjellige former for stress 10 , kan IF-aggregering også bidra til funksjonell nedgang under aldring. Imidlertid mangler studier på organisasjonsnivå som undersøker flere pattedyr IF-proteiner på tvers av forskjellige vev under stress. IF er svært dynamiske strukturer som tilpasser seg for å oppfylle mobilkrav. Keratiner, for eksempel, gjennomgår en biosyntese-uavhengig sykling mellom oppløselig (ikke-filamentøs) og uoppløselig (filamentøs) proteinbasseng 13 . Under normale fysiologiske forhold ca. 5% kan det totale K8 / K18 bassenget ekstraheres i vaskemiddelfri buffer i forhold til ca. 20% som kan oppløses i det ikke-ioniske vaskemiddelet Nonidet P-40, som er biokjemisk sammenlignbart med Triton- X100 14 , </sOpp&gt; 15 . Under mitose er det en merkbar økning i oppløseligheten av enkeltypepitel K8 og K1814, noe som er mindre tydelig i epidermale keratiner, men mer tydelig i vimentin og andre type III IF-proteiner 15 , 16 . Opløselighetsegenskaper for IF-proteiner reguleres tett ved fosforylering, en nøkkel posttranslasjonell modifisering (PTM) for filamentomretting og oppløselighet 17 , 18 , 19 , 20 . De fleste IF&#39;er gjennomgår omfattende regulering av en rekke PTMer på konserverte steder, noe som resulterer i funksjonelle endringer 17 . Formålet med denne metoden er å introdusere etterforskere som er nye for IF-feltet til biokjemisk utvinning og analysemetoder for studier av IF-proteiner på tvers av flere musevev. SpesifikkAlliert, fokuserer vi på isolering av IF-proteiner ved hjelp av en høysalt-ekstraksjonsmetode og vurdering av endringer i PTMs via massespektrometri og ved PTM-målende antistoffer. Disse metodene bygger på tidligere publiserte prosedyrer 21, men inkluderer modifikasjoner for ekstraksjon av forskjellige IF-proteintyper for å avdekke felles mekanisme for regulering over IF-familien. For eksempel regulerer K8-acetylering ved en bestemt lysinrest filamentorganisasjon, mens hyperacetylering fremmer K8-uløselighet og aggregatdannelse 22 . Nyere globale proteomiske profileringsstudier har i tillegg avdekket at de fleste vevsspesifikke IF-proteiner også er mål for acetylering, og at de fleste IF-acetyleringssteder er begrenset til det høyt konserverte stangdomenet. Dette understreker behovet for metoder som er egnet for global profilering av IF-systemet. Vi introduserer også en rask metode for å isolere IF-proteiner fra flere vev ved hjelp av automatisert homogenisering i optikkMisert lyseringsmatrise. De resulterende preparater er egnet for nedstrøms PTM analyse via massespektrometri og andre metoder.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10009</td>
			<td>immunoprecipitation beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>for buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink RNA mini kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12183018</td>
			<td>RNA extraction from tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink DNAse set</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12185010A</td>
			<td>on column DNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamag-2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>magnet for use with dynabeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelCode Blue Stain Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24592</td>
			<td>mass spectrometry-compatible gel stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td>for use in western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA reverse transcription kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4368813</td>
			<td>for use in gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proflex 3x32-well PCR System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4484073</td>
			<td>PCR system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF transfer membrane&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88520</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Up SYBR master mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A25778</td>
			<td>for qPCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM7020</td>
			<td>solution for tissue storage prior to RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex 4-20% Tris Glycine Gel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>Precast protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Keratin 8 antibody (TS1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA514428</td>
			<td>for western blot detection of K8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA511883</td>
			<td>for western blot detection of vimentin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Glycine Transfer Buffer (25X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC3675</td>
			<td>for wet transfer of protein gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SDS Sample Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>for preparing protein gel samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Glycine SDS Running Buffer (10X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC26755</td>
			<td>for running protein gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing beads - Matrix D</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116913100</td>
			<td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing beads - Matrix SS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116921100</td>
			<td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-LITE</td>
			<td>measurement of protein and nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>EQ03119</td>
			<td>Automated tissue homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intermediate filament proteins from multiple mouse tissues to study aging-associated post-translational modifications

Mellomliggende filamenter (IFs), sammen med aktinfilamenter og mikrotubuli, danner cytoskelettet - et kritisk strukturelt element i hver celle. Normal funksjon IFs gir celler med mekanisk og spenningsfasthet, mens en dysfunksjonell IF-cytoskelett kompromitterer cellulær helse og har vært assosiert med mange humane sykdommer. Post-translational modifikasjoner (PTM) regulerer kritisk IF-dynamikk som respons på fysiologiske endringer og under stressforhold. Derfor kan evnen til å overvåke endringer i PTM-signaturen til IF&#39;er bidra til en bedre funksjonell forståelse, og i siste instans, av IF-systemet som en stressrespons under cellulær skade. Imidlertid er det store antallet IF-proteiner, som er kodet av over 70 individuelle gener og uttrykt på en vevsavhengig måte, en stor utfordring ved å sortere ut den relative betydningen av forskjellige PTM. Til dette formål, metoder som muliggjør overvåking av PTM på IF-proteinerPå et organisasjonsnivå, i stedet for isolerte medlemmer av familien, kan akselerere forskningsprosessene på dette området. Her presenterer vi biokjemiske metoder for isolering av total, vaskemiddeloppløselig og vaskemiddelresistent fraksjon av IF-proteiner fra 9 forskjellige musevev (hjerne, hjerte, lunge, lever, tynntarm, tykktarmen, bukspyttkjertelen, nyrene og milt). Vi demonstrerer videre en optimalisert protokoll for rask isolering av IF-proteiner ved å bruke lyseringsmatrise og automatisert homogenisering av forskjellige musevev. Den automatiserte protokollen er nyttig for profiling av IFs i eksperimenter med høyt prøvevolum (for eksempel i sykdomsmodeller som involverer flere dyr og eksperimentelle grupper). De resulterende prøvene kan benyttes for forskjellige nedstrømsanalyser, inkludert massespektrometribasert PTM-profilering. Ved hjelp av disse metodene, gir vi nye data som viser at IF-proteiner i forskjellige musevev (hjernen og leveren) gjennomgår parallelle endringer med hensyn til deres uttrykkSionnivåer og PTM under aldring.

En ny rask metode for høy saltbasert ekstraksjon av IF-proteiner fra flere musvev som bruker lyseringsmatrise. Den tradisjonelle metode 25 , 26 for isolering av hovedparten av mellomfilamentproteinfraksjonen fra epitelvev ble modifisert her for å inkludere 9 forskjellige organer og en raskere prosedyre for vevsl...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications at JoVE.com

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

I denne metoden presenterer vi biokjemiske prosedyrer for rask og effektiv isolering av mellomfilament (IF) proteiner fra flere musevev. Isolerte IF&#39;er kan brukes til å studere endringer i posttranslasjonelle modifikasjoner ved massespektrometri og andre biokjemiske analyser.

Isolering av mellomproduktfilamentproteiner fra flere musvæsker til studie aldringsassosierte posttranslatoriske modifikasjoner

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

En metode for måling av RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Endringer i celler og vev

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Nuclear Magnetic Resonance spektroskopi for identifisering av flere Phosphorylations med egen Uordnede Proteiner

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Bruker en omfattende Immunoprecipitation berikelse System for å identifisere en endogen post-translasjonell modifikasjon profil for målet proteiner

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolasjonen av Glomeruli og i Vivo merking av Glomerular celle overflaten proteiner

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Looking utover: isolering av Cyanobacterial Released karbohydrater polymerer og proteiner

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Profilering Ubiquitin og Ubiquitin-lignende avhengige post-translational modifikasjoner og identifisering av vesentlige endringer

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tverrgående seksjonering av eldre ris (Oryza sativa L.) Kjerner for skanning av elektronmikroskopiavbildning ved hjelp av pipettespisser som immobiliseringsstøtte

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

Rensing av Tubulin med kontrollerte posttranslasjonelle modifikasjoner og isotyper fra begrensede kilder ved polymerisering-depolymeriseringssykluser

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Rensing av allestedsnærværende p53-proteiner fra pattedyrceller

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Høyoppløselig nøytronspektroskopi for å studere picosekund-nanosekunddynamikk av proteiner og hydreringsvann

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...