Name: isolation of intermediate filament proteins from multiple mouse tissues to study aging-associated post-translational modifications
Uploaded: 2017-05-18T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el NIH otorga NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS], y P30 DK034987 [a UNC-Chapel Hill]. Los autores agradecen a Deekshita Ramanarayanan por su ayuda con los experimentos de qPCR y western blot.

El protocolo es aprobado y realizado de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Universidad de Carolina del Norte. 1. Preparaciones <ol><li> Preparar tampón Triton-X (Triton X-100 al 1%, ácido etilendiaminotetraacético 5 mM (EDTA), aumentar el volumen en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4). Para preparar 500 ml: mezclar 5 ml cada uno de Triton X-100 y 500 mM de EDTA en 490 ml de PBS, pH 7,4. Guarde la solución tampón Triton-X a 4 ° C. </li><li> Pr...

Los métodos que permiten la caracterización bioquímica de las proteínas IF pueden ser útiles para entender numerosos fenómenos fisiopatológicos en los sistemas de mamíferos, ya que las proteínas IF son a la vez marcadores y moduladores del estrés celular y tisular 29 . El principio detrás del método actual se basa en los procedimientos iniciales desarrollados en los años 70 y 80 para aislar, separar y reconstituir las proteínas IF de las células y tejidos, empleando generalmente so...

<html> Las IF son una familia de proteínas que en los seres humanos están codificadas por 73 genes y categorizadas en seis tipos principales: los tipos I a IV son citoplásmicos ( por ejemplo, queratinas epiteliales y capilares (K), mi- cito desmina, neurofilamentos, proteína glicolar fibrilar (GFAP) y otros); Tipo V son las láminas nucleares; Y el tipo VI son IFs en la lente ocular 1 . En cuanto a su organización molecular, las proteínas IF tienen tres dominios comunes: un dominio &quot;varado&quot; de bobina en espiral altamente conservado y dominios globulares de &quot;cabeza&quot; y &quot;cola&quot;. Los tetrámeros de proteínas IF se unen para formar precursores de filamentos cortos, que finalmente se incorporan en filamentos maduros que forman estructuras citoesqueléticas y nucleoesqueléticas dinámicas involucradas en la protección mecánica 2 , la detección de estrés 3 , 4 , la regulación de la transcripción 5 y el crecimiento y otras funciones celulares críticas&quot;&gt; 1 , 6 , 7 . La importancia funcional del sistema de IF se pone de relieve por la existencia de muchas enfermedades humanas causadas por mutaciones missense en genes de IF, incluyendo neuropatías, miopatías, trastornos de la fragilidad de la piel, disfunciones metabólicas y síndromes de envejecimiento prematuro 8 . Algunas mutaciones del gen IF no causan, pero predisponen a sus portadores a la progresión de la enfermedad, como las queratinas epiteliales simples en la enfermedad hepática 9 . Este último se debe a las funciones críticas de protección del estrés de las IF en los epitelios. Las IF en general se encuentran entre las proteínas celulares más abundantes en condiciones basales, pero se induce además fuertemente durante varios tipos de estrés 10 . Por ejemplo, estudios recientes que evalúan los cambios en todo el proteoma en el nematodo C. elegans demostraron que múltiples IFs están altamente reguladas y propensas a agregatiDurante el envejecimiento del organismo 11 , 12 . Dado que el mantenimiento de una estructura de IF adecuada es esencial para la resistencia celular a diversas formas de estrés 10 , la agregación de IF también puede contribuir a la disminución funcional durante el envejecimiento. Sin embargo, los estudios a nivel de organismal que examinan múltiples proteínas de mamífero IF a través de diferentes tejidos sometidos a estrés son deficientes. Las IF son estructuras altamente dinámicas que se adaptan para satisfacer las demandas celulares. Las queratinas, por ejemplo, experimentan un ciclo independiente de biosíntesis entre el pool de proteínas solubles (no filamentosas) e insolubles (filamentosas) 13 . En condiciones fisiológicas normales, aproximadamente el 5% del total de K8 / K18 se puede extraer en tampón exento de detergente, en comparación con aproximadamente 20% que se puede solubilizar en el detergente no iónico Nonidet P-40, que es bioquímicamente comparable al Triton- X100 14 , </sArriba&gt; 15 . Durante la mitosis hay un notable aumento en la solubilidad de los epitelios de tipo simple K8 y K18 14 , que es menos evidente en las queratinas epidérmicas, pero más evidente en la vimentina y otras proteínas tipo III IF [ 15 , 16] . Las propiedades de solubilidad de las proteínas IF están estrechamente reguladas por la fosforilación, una modificación clave post-traduccional (PTM) para el reordenamiento de los filamentos y la solubilidad 17 , 18 , 19 , 20 . La mayoría de las IF se someten a regulación extensiva por una serie de PTM en sitios conservados, lo que resulta en cambios funcionales [ 17] . El propósito de este método es introducir a los investigadores que son nuevos en el campo de IF a la extracción bioquímica y métodos analíticos para el estudio de las proteínas de IF a través de múltiples tejidos de ratón. EspecíficoNos centramos en el aislamiento de las proteínas IF utilizando un método de extracción de alta sal y la evaluación de los cambios en PTMs a través de espectrometría de masas y por anticuerpos dirigidos a PTM. Estos métodos se basan en los procedimientos publicados anteriormente 21, pero incluyen modificaciones para extraer diferentes tipos de proteínas IF para descubrir el mecanismo común de regulación en toda la familia IF. Por ejemplo, la acetilación de K8 en un residuo de lisina específico regula la organización del filamento, mientras que la hiperacetilación promueve la insolubilidad de K8 y la formación de agregados 22 . Recientes estudios de perfiles proteómicos globales han revelado adicionalmente que la mayoría de las proteínas específicas de tejido IF son también objetivos para la acetilación y que la mayoría de los sitios de acetilación IF están confinados al dominio de barras altamente conservadas. Esto pone de manifiesto la necesidad de métodos adecuados para el perfil global del sistema IF. También se introduce un método rápido de aislamiento IF proteínas de múltiples tejidos utilizando homogeneización automatizada en optiMatriz de lisis. Las preparaciones resultantes son adecuadas para análisis PTM aguas abajo a través de espectrometría de masas y otros métodos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10009</td>
			<td>immunoprecipitation beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>for buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink RNA mini kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12183018</td>
			<td>RNA extraction from tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink DNAse set</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12185010A</td>
			<td>on column DNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamag-2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>magnet for use with dynabeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelCode Blue Stain Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24592</td>
			<td>mass spectrometry-compatible gel stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td>for use in western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA reverse transcription kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4368813</td>
			<td>for use in gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proflex 3x32-well PCR System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4484073</td>
			<td>PCR system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF transfer membrane&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88520</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Up SYBR master mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A25778</td>
			<td>for qPCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM7020</td>
			<td>solution for tissue storage prior to RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex 4-20% Tris Glycine Gel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>Precast protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Keratin 8 antibody (TS1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA514428</td>
			<td>for western blot detection of K8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA511883</td>
			<td>for western blot detection of vimentin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Glycine Transfer Buffer (25X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC3675</td>
			<td>for wet transfer of protein gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SDS Sample Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>for preparing protein gel samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Glycine SDS Running Buffer (10X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC26755</td>
			<td>for running protein gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing beads - Matrix D</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116913100</td>
			<td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing beads - Matrix SS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116921100</td>
			<td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-LITE</td>
			<td>measurement of protein and nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>EQ03119</td>
			<td>Automated tissue homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intermediate filament proteins from multiple mouse tissues to study aging-associated post-translational modifications

Los filamentos intermedios (IF), junto con filamentos de actina y microtúbulos, forman el citoesqueleto, un elemento estructural crítico de cada célula. El funcionamiento normal de las IF proporciona a las células resistencia mecánica y al estrés, mientras que un citoesqueleto disfuncional de IF compromete la salud celular y se ha asociado con muchas enfermedades humanas. Las modificaciones postraduccionales (PTMs) regulan críticamente la dinámica de IF en respuesta a cambios fisiológicos y bajo condiciones de estrés. Por lo tanto, la capacidad de supervisar los cambios en la firma PTM de IFs puede contribuir a una mejor comprensión funcional y, en última instancia, condicionamiento del sistema IF como un respondedor de estrés durante la lesión celular. Sin embargo, el gran número de proteínas IF, que están codificadas por más de 70 genes individuales y se expresan de una manera dependiente de los tejidos, es un reto importante para clasificar la importancia relativa de diferentes PTMs. Con este fin, los métodos que permiten el monitoreo de PTMs sobre las proteínas IFA nivel de todo el organismo, y no para miembros aislados de la familia, puede acelerar el progreso de la investigación en esta área. Aquí presentamos métodos bioquímicos para el aislamiento de la fracción total, soluble en detergente y resistente al detergente de las proteínas IF de 9 tejidos de ratón diferentes (cerebro, corazón, pulmón, hígado, intestino delgado, intestino grueso, páncreas, riñón y bazo). Demostramos además un protocolo optimizado para el aislamiento rápido de las proteínas IF utilizando matriz de lisis y homogeneización automatizada de diferentes tejidos de ratón. El protocolo automatizado es útil para perfilar IFs en experimentos con alto volumen de muestra (tal como en modelos de enfermedad que implican múltiples animales y grupos experimentales). Las muestras resultantes pueden utilizarse para diversos análisis de aguas abajo, incluyendo el perfilado de PTM basado en espectrometría de masas. Utilizando estos métodos, proporcionamos nuevos datos para demostrar que las proteínas IF en diferentes tejidos de ratón (cerebro e hígado) experimentan cambios paralelos con respecto a su expresiónY los PTM durante el envejecimiento.

Un nuevo método rápido para la alta extracción basada en sal de las proteínas de IF de múltiples tejidos de ratón utilizando lysing matriz. El método tradicional 25 , 26 de aislar el grueso de la fracción de proteína de filamento intermedio del tejido epitelial se modificó aquí para incluir 9 órganos d...

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Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

En este método, presentamos procedimientos bioquímicos para el aislamiento rápido y eficiente de proteínas de filamento intermedio (IF) de múltiples tejidos de ratón. Se pueden usar IFs aisladas para estudiar los cambios en las modificaciones postraduccionales por espectrometría de masas y otros ensayos bioquímicos.

Aislamiento de proteínas de filamento intermedio de múltiples tejidos de ratón para estudiar las modificaciones postraduccionales asociadas al envejecimiento

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

Un método para medir el ARN<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Modificaciones en células y tejidos

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Investigación

Bioquímica

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Nuclear espectroscopía de resonancia magnética para la identificación de múltiples fosforilaciones de proteínas intrínsecamente desordenadas

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Utilizando un sistema de enriquecimiento integral inmunoprecipitación para identificar un perfil endógeno modificación poste-de translación de proteínas blanco

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Aislamiento de glomérulos y en Vivo de etiquetado de proteínas de la superficie celular Glomerular

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Mirando hacia afuera: Aislamiento de polímeros y proteínas de carbohidratos liberados de cianobacteria

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Perfilado de Ubiquitina y Ubiquitina-como Modificaciones Post-traduccionales dependientes e Identificación de Alteraciones Significativas

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Seccionamiento transversal de arroz maduro (Oryza sativa L.) Núcleos para imágenes de microscopía electrónica de barrido utilizando puntas de pipeta como soporte de inmovilización

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

Purificación de tubulina con modificaciones posttranslacionales controladas e isotipos de fuentes limitadas por ciclos de polimerización-despolimerización

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Purificación de proteínas p53 ubiquitinadas a partir de células de mamíferos

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Espectroscopía de neutrones de alta resolución para estudiar la dinámica de picosegundos-nanosegundos de proteínas y agua de hidratación

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...