Name: isolation of intermediate filament proteins from multiple mouse tissues to study aging-associated post-translational modifications
Uploaded: 2017-05-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH-bidrag NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] och P30 DK034987 [till UNC-Chapel Hill]. Författarna tackar Deekshita Ramanarayanan för hjälp med qPCR och western blot-experiment.

Protokollet godkänns och utförs i enlighet med Institutionen för djurvård och användningskommitté (IACUC) vid University of North Carolina. 1. Förberedelser <ol><li> Bered Triton-X-buffert (1% Triton X-100, 5 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), höj volymen i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,4). För att göra 500 ml: rör om 5 ml vardera av Triton X-100 och 500 mM EDTA i 490 ml PBS, pH 7,4. Förvara Triton-X buffertlösning vid 4 ° C. </li><li> Framställ hög saltbuffert (10 mM Tris-HCl, pH ...

Metoder som möjliggör biokemisk karakterisering av IF-proteiner kan vara användbara för att förstå många patofysiologiska fenomen i däggdjursystem, eftersom IF-proteiner är både markörer och modulatorer av cellulär och vävnadsspänning 29 . Principen bakom den nuvarande metoden är baserad på de initiala procedurer som utvecklats på 1970-talet och 1980-talet för att isolera, separera och rekonstruera IF-proteiner från celler och vävnader, som i allmänhet använder låg- och hö...

<html> IFs är en familj av proteiner som kodas av människor hos 73 gener och kategoriseras i sex huvudtyper: typerna I-IV är cytoplasmatiska ( t ex epitel- och hårkeratiner (K), myocyt desmin, neurofilament, glialfibrillärt surt protein (GFAP), och andra); Typ V är nukleära laminer; Och typ VI är IF i ögonlinsen 1 . När det gäller deras molekylära organisation har IF-proteiner tre vanliga domäner: en högt konserverad domän med spolad spole &quot;rod&quot; och globala domäner &quot;huvud&quot; och &quot;svans&quot;. IF-proteintetramerer monteras för att bilda korta trådprekursorer, vilka slutligen införlivas i mogna filament som bildar dynamiska cytoskeletala och nukleoskeletala strukturer som är involverade i mekaniskt skydd 2 , spänningsavkänning 3 , 4 , reglering av transkription 5 och tillväxt och andra kritiska cellulära funktioner&quot;&gt; 1 , 6 , 7 . IF-systemets funktionella betydelse framhävs av förekomsten av många mänskliga sjukdomar orsakade av missensmutationer i IF-gener, inklusive neuropatier, myopatier, hudbräckningsstörningar, metaboliska dysfunktioner och för tidigt åldrande syndrom 8 . Några IF-genmutationer orsakar inte, men predisponerar deras bärare till sjukdomsprogression, såsom enkla epithelialkeratiner i leversjukdom 9 . Det senare beror på de kritiska stressskyddande funktionerna hos IF i epitel. IFs i allmänhet är bland de vanligast förekommande cellulära proteinerna under basala betingelser, men induceras vidare starkt under olika typer av stress 10 . Exempelvis visade nyligen studier som utvärderar proteombranta förändringar i nematoden C. elegans att flera IF är högt uppreglerade och benägna att aggregeraPå under organismens åldrande 11 , 12 . Eftersom underhåll av en riktig IF-struktur är väsentlig för cellulär resistans mot olika former av stress 10 kan IF-aggregering också bidra till den funktionella nedgången under åldring. Emellertid saknas studier på organismer nivå som undersöker flera däggdjurs-IF-proteiner över olika vävnader som utsätts för stress. IF är högdynamiska strukturer som anpassar sig för att möta cellulära krav. Keratiner genomgår exempelvis en biosyntes-oberoende cykling mellan löslig (icke-trådformig) och olöslig (trådformig) proteinpool 13 . Under normala fysiologiska förhållanden kan cirka 5% den totala K8 / K18 poolen extraheras i tvättfri buffert, jämfört med ca 20% som kan lösas i det nonjoniska diskmedelet Nonidet P-40, vilket är biokemiskt jämförbart med Triton- X100 14 , </sUpp&gt; 15 . Under mitos finns en märkbar ökning av lösligheten hos epitel K8 och K18 14 av enkeltyp, vilket är mindre uppenbart i epidermala keratiner men mer uppenbart i vimentin och andra typ III IF-proteiner 15 , 16 . Löslighetsegenskaper för IF-proteiner regleras tätt genom fosforylering, en nyckel efter translationell modifiering (PTM) för filamentomläggning och löslighet 17 , 18 , 19 , 20 . De flesta IFs genomgår omfattande reglering av ett antal PTM på konserverade platser, vilket resulterar i funktionella förändringar 17 . Syftet med denna metod är att introducera utredare som är nya på IF-området för biokemisk extraktion och analysmetoder för studier av IF-proteiner över flera musvävnader. SpecifikAllierade fokuserar vi på isolering av IF-proteiner med hjälp av en extraktionsmetod med hög salt och bedömning av förändringar i PTM genom masspektrometri och PTM-riktande antikroppar. Dessa metoder bygger på tidigare publicerade procedurer 21 men innefattar modifieringar för att extrahera olika IF-proteintyper för att avslöja gemensam mekanism för reglering över IF-familjen. Exempelvis reglerar K8-acetylering vid en specifik lysinrest en filamentorganisation, medan hyperacetylering främjar K8-olöslighet och aggregatbildning 22 . Nya globala proteom profileringsstudier har dessutom visat att de flesta vävnadsspecifika IF-proteiner också är mål för acetylering och att de flesta IF-acetyleringsställen är begränsade till den starkt konserverade stångdomänen. Detta belyser behovet av metoder som är lämpliga för global profilering av IF-systemet. Vi introducerar också en snabb metod för att isolera IF-proteiner från flera vävnader med hjälp av automatiserad homogenisering i optiMiserad lyseringsmatris. De resulterande preparaten är lämpliga för nedströms PTM-analys via masspektrometri och andra metoder.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10009</td>
			<td>immunoprecipitation beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>for buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink RNA mini kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12183018</td>
			<td>RNA extraction from tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink DNAse set</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12185010A</td>
			<td>on column DNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamag-2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>magnet for use with dynabeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelCode Blue Stain Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24592</td>
			<td>mass spectrometry-compatible gel stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td>for use in western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA reverse transcription kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4368813</td>
			<td>for use in gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proflex 3x32-well PCR System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4484073</td>
			<td>PCR system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF transfer membrane&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88520</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Up SYBR master mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A25778</td>
			<td>for qPCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM7020</td>
			<td>solution for tissue storage prior to RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex 4-20% Tris Glycine Gel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>Precast protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Keratin 8 antibody (TS1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA514428</td>
			<td>for western blot detection of K8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA511883</td>
			<td>for western blot detection of vimentin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Glycine Transfer Buffer (25X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC3675</td>
			<td>for wet transfer of protein gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SDS Sample Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>for preparing protein gel samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Glycine SDS Running Buffer (10X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC26755</td>
			<td>for running protein gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing beads - Matrix D</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116913100</td>
			<td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing beads - Matrix SS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116921100</td>
			<td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-LITE</td>
			<td>measurement of protein and nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>EQ03119</td>
			<td>Automated tissue homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intermediate filament proteins from multiple mouse tissues to study aging-associated post-translational modifications

Mellanliggande filament (IF), tillsammans med aktinfilament och mikrotubuli, bildar cytoskeletten - ett kritiskt strukturellt element i varje cell. Normal funktion IFs ger celler med mekanisk och spänningsfasthet, medan en dysfunktionell IF-cytoskelett äventyrar cellulär hälsa och har associerats med många mänskliga sjukdomar. Post-translationella modifieringar (PTM) reglerar IF-dynamiken kritiskt på grund av fysiologiska förändringar och stressförhållanden. Därför kan förmågan att övervaka förändringar i PTM-signaturen av IFs bidra till en bättre funktionell förståelse, och slutligen konditionering, av IF-systemet som en stressrespons under cellulär skada. Emellertid är det stora antalet IF-proteiner, som kodas av över 70 individuella gener och uttryckta på vävnadsberoende sätt, en stor utmaning för att sortera ut den relativa betydelsen av olika PTM. För det ändamålet, metoder som möjliggör övervakning av PTM på IF-proteinerPå en organismövergripande nivå, snarare än för isolerade familjemedlemmar, kan påskynda forskningens framsteg på detta område. Här presenterar vi biokemiska metoder för isolering av den totala, tvättmedelslösliga och tvättmedelsbeständiga fraktionen av IF-proteiner från 9 olika musvävnader (hjärna, hjärta, lung, lever, tunntarmen, tjocktarmen, bukspottkörteln, njuren och mjälte). Vi demonstrerar vidare ett optimerat protokoll för snabb isolering av IF-proteiner genom att använda lyseringsmatris och automatiserad homogenisering av olika musvävnader. Det automatiska protokollet är användbart för profilering av IFs i experiment med hög provvolym (såsom i sjukdomsmodeller som involverar flera djur och experimentella grupper). De resulterande proven kan användas för olika nedströmsanalyser, innefattande masspektrometribaserad PTM-profilering. Genom att använda dessa metoder tillhandahåller vi nya data för att visa att IF-proteiner i olika musvävnader (hjärna och lever) genomgår parallella förändringar med avseende på deras uttryckSionnivåer och PTM under åldrandet.

En ny snabb metod för hög saltbaserad extraktion av IF-proteiner från flera musvävnader med användning av lysningsmatris. Den traditionella metoden 25 , 26 för att isolera huvuddelen av den mellanliggande filamentproteinfraktionen från epitelvävnad modifierades här för att inkludera 9 olika organ och ett...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications at JoVE.com

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

I denna metod presenterar vi biokemiska förfaranden för snabb och effektiv isolering av mellanfilament (IF) proteiner från flera musvävnader. Isolerade IF kan användas för att studera förändringar i posttranslationella modifieringar genom masspektrometri och andra biokemiska analyser.

Isolering av intermediära filamentproteiner från flera musvävnader för att studera åldringsrelaterade posttranslationella modifieringar

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

En metod för mätning av RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Ändringar i celler och vävnader

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Kärnmagnetisk resonansspektroskopi för identifiering av flera fosforyleringar av egen Oordnade proteiner

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Använda ett omfattande Immunoprecipitation berikning System för att identifiera en endogen posttranslationella modifieringen profil för målproteiner

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolering av Glomeruli och In Vivo märkning av glomerulär Cell ytproteiner

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Ser utåt: isolering av Cyanobakterial släppt kolhydrat polymerer och proteiner

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Profilering ubiquitin och ubiquitin-liknande beroende post-translationella modifieringar och identifiering av betydande förändringar

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tvärgående sektionering av moget ris (Oryza sativa L.) Kärnor för skanning av elektronmikroskopiavbildning med pipettespetsar som immobiliseringsstöd

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

Rening av tubulin med kontrollerade posttranslational modifieringar och isotyper från begränsade källor genom polymerisation-depolymeriseringscykler

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Rening av Ubiquitinated p53-proteiner från däggdjursceller

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Högupplöst neutronspektroskopi för att studera pikosekund-nanosekunddynamik hos proteiner och hydratiseringsvatten

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...