Name: assay to measure nucleocytoplasmic transport in real time within motor neuron-like nsc-34 cells
Uploaded: 2017-05-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells at JoVE.com

हम अपने सहायक टिप्पणियों और सुझावों के लिए एआई प्रयोगशाला के सभी सदस्यों का धन्यवाद करते हैं। हम शटल-जीएफपी वेक्टर प्रदान करने के लिए प्रो। मार्क हिप्प (जैक्सैमिस्ट्री के मैक्स प्लैंक इंस्टीट्यूट) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। इस काम को इज़राइली साइंस फाउंडेशन (आईएसएफ # 124/14), बिजनेस साइंस फाउंडेशन (बीएसएफ # 2013325), एफपी 7 मैरी क्यूरी कैरियर इंटीग्रेशन ग्रांट (सीआईजी # 3337 9 4), और इसराइल में मनोवैज्ञानिक के लिए राष्ट्रीय संस्थान एनआईपीआई # बी 133-14 / 15)

1. सेल लाइन तैयारी <ol><li> करीब 1,000,000 माउस न्यूरोब्लास्टोमा स्पाइनल कॉर्ड कोशिकाएं (एनएससी -34 कोशिकाएं) जो एक तरल नाइट्रोजन कंटेनर में संग्रहीत होती थी। 37 डिग्री सेल्सियस पानी के इनक्यूबेटर का उपयोग करें जब ?...

<ol>
	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (2002).</li><li>Freitas, N., Cunha, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+signals+for+the+nuclear+import+of+proteins.">Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins.</a> Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).</li><li>Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short+amino+acid+sequence+able+to+specify+nuclear+location.">A short amino acid sequence able to specify nuclear location.</a> Cell. 39, 499-509 (1984).</li><li>la Cour, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+prediction+of+leucine-rich+nuclear+export+signals.">Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals.</a> Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS/FTD.">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Sci Rep. 6, 20877 (2016).</li><li>Freibaum, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GGGGCC+repeat+expansion+in+C9orf72+compromises+nucleocytoplasmic+transport.">GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 129-133 (2015).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).</li><li>Kwon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeats+bind+nucleoli,+impede+RNA+biogenesis,+and+kill+cells.">Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells.</a> Science. 345, 1139-1145 (2014).</li><li>Rossi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+accumulation+of+mRNAs+underlies+G4C2-repeat-induced+translational+repression+in+a+cellular+model+of+C9orf72+ALS.">Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS.</a> J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).</li><li>Shi, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+PRn+poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeat+expansion+block+nuclear+import+and+export.">Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C9orf72+repeat+expansion+disrupts+nucleocytoplasmic+transport.">The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 56-61 (2015).</li><li>Zhang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9ORF72+poly(GA)+aggregates+sequester+and+impair+HR23+and+nucleocytoplasmic+transport+proteins.">C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins.</a> Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).</li><li>Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Charcot+to+Lou+Gehrig:+deciphering+selective+motor+neuron+death+in+ALS.">From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).</li><li>DeJesus-Hernandez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+GGGGCC+hexanucleotide+repeat+in+noncoding+region+of+C9ORF72+causes+chromosome+9p-linked+FTD+and+ALS.">Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS.</a> Neuron. 72, 245-256 (2011).</li><li>Renton, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hexanucleotide+repeat+expansion+in+C9ORF72+is+the+cause+of+chromosome+9p21-linked+ALS-FTD.">A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD.</a> Neuron. 72, 257-268 (2011).</li><li>Boeve, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+frontotemporal+dementia+and/or+amyotrophic+lateral+sclerosis+associated+with+the+GGGGCC+repeat+expansion+in+C9ORF72.">Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72.</a> Brain. 135, 765-783 (2012).</li><li>Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+biology+of+the+C9orf72+nucleotide+repeat+expansion+in+neurodegenerative+disease.">The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease.</a> Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).</li><li>Woerner, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+aggregates+interfere+with+nucleocytoplasmic+transport+of+protein+and+RNA.">Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA.</a> Science. 351, 173-176 (2016).</li><li>Tao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+stress+and+impaired+stress+granule+formation+contribute+to+C9orf72+RAN+translation-induced+cytotoxicity.">Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity.</a> Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).</li><li>Wen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+proline-arginine+RAN+dipeptides+linked+to+C9ORF72-ALS/FTD+form+toxic+nuclear+aggregates+that+initiate+in+vitro+and+in+vivo+neuronal+death.">Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death.</a> Neuron. 84, 1213-1225 (2014).</li></ol>

यह प्रोटोकॉल एक बेहद संवेदनशील और मात्रात्मक नई परख को दर्शाता है जो कि न्यूक्लियोकॉप्टोस्लास्मिक परिवहन में मिनट के परिवर्तनों का मूल्यांकन करता है। इस प्रणाली का प्रयोग करके, वास्तविक समय में न्य...

परमाणु ताकना जटिल (एनपीसी) सेल नाभिक में और बाहर बड़े अणुओं के आयात और निर्यात को नियंत्रित करता है। छोटे अणुओं के विपरीत, जो विनियमन 1 के बिना नाभिक में प्रवेश कर सकते हैं, बड़े अणुओं के परिवहन को एनपीसी द्वारा दृढ़ता से नियंत्रित किया जाता है। इन बड़े अणुओं जैसे कि प्रोटीन और आरएनए, आयातकों और निर्यातकों सहित परिवहन कारकों के साथ सहयोगी, को नाभिक 2 से आयात और निर्यात किया जा सकता है। आयात करने के लिए, प्रोटीन में एक छोटा पेप्टाइड आकृति होती है, जिसे आम तौर पर एक परमाणु स्थानीयकरण संकेत (एनएलएस) कहा जाता है, जो कि आयातकों द्वारा बाध्य होती है 2 । एमिनो एसिड के ये अनुक्रम एक टैग के रूप में कार्य करते हैं और रचना 3 , 4 में विविध हैं। निर्यातक के साथ उनके सहयोग के कारण प्रोटीन को नाभिक से सीओप्लाज्म में निर्यात किया जा सकता हैएस, जो एक सिग्नल अनुक्रम बाँधते हैं, जिसे आम तौर पर परमाणु निर्यात संकेत (एनईएस) 2 कहा जाता है छोटे रास से संबंधित परमाणु प्रोटीन जीटीपेज (रेन) 2 के विनियमन के कारण आयातकों और निर्यातकों दोनों ही अपने माल को परिवहन में सक्षम हैं। विभिन्न गठनात्मक राज्यों में चलने का अस्तित्व दिखाया गया है, इस पर निर्भर करता है कि क्या वह जीटीपी या जीडीपी के लिए बाध्य है या नहीं। जब जीटीपी के लिए बाध्य है, तो रन आयातकों या निर्यातकों से जुड़ा हो सकता है। रान जीटीपी के लिए बंधन पर आयातकों ने अपना माल छोड़ दिया, जबकि निर्यातकों को अपने निर्यात कार्गो के साथ एक जटिल बनाने के लिए रान जीटीपी को बाध्य करना चाहिए। प्रमुख न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी स्थिति, नाभिक (RanGTP) या साइटोप्लाज्म (रानजीडीपी) में अपने स्थान पर निर्भर करती है। हाल ही में, कई अध्ययनों से न्यूक्लोकॉटेप्लस्मेक मार्ग में अपर्याप्तता और दोनों एमीट्रोफिक पार्श्व कैंसर (एएलएस) और फ्रंटोटेमपोरल डिमेंशिया (एफटीडी) 5 , 6 </sup&gt; , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 एएलएस एक प्रगतिशील और घातक neurodegenerative रोग दोनों ऊपरी और निचले मोटर न्यूरॉन्स (एमएनएस) 13 को प्रभावित करता है और जिसके परिणामस्वरूप पक्षाघात और अंततः मृत्यु में, औसतन 2-5 वर्षों के भीतर। एएलएस के अधिकांश मामलों को छिटपुट (एसएएलएस) के रूप में वर्गीकृत किया जाता है, जिसमें कोई भी स्पष्ट आनुवंशिक संबंध नहीं होता है, लेकिन 10% एक प्रभावी तरीके से विरासत में मिला है (पारिवारिक एएलएस; FALS)। हाल ही में, क्रोमोज़म 9 खुले पढ़ने के फ्रेम 72 (सी 9orf72) जीन में हेक्साएनक्लियोटाइड दोहराए विस्तार (एचआरई) 14 , 15 को एएलएस और एफटीडीए के आनुवांशिक कारण के रूप में पहचाने गए थे। इन म्यूटेंट के कारण फलों के मामलों के 30-40% मामलों 16 के लिए है , और विभिन्न अध्ययनों का तर्क हैकि वे न्यूक्लूसोप्लास्मेक परिवहन 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 को प्रभावित करके विषाक्तता का कारण बनाते हैं। इन अध्ययनों में ज्यादातर न्यूक्लूसोप्लास्मेक परिवहन पर एचआरई के अंतिम परिणाम और अभिव्यक्तियों को दिखाया गया है, लेकिन वे वास्तविक समय में न्यूक्लियोक्साइटप्लाज्मिक व्यवधान का प्रदर्शन नहीं करते हैं। नतीजतन, केवल गंभीर न्यूक्लोकोसाइटोप्लास्मिक परिवहन की कमी 11 , 17 , 18 का मूल्यांकन किया गया है। इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक नया और veवास्तविक समय में न्यूक्लोकॉस्प्टोस्लॉजिकिक ट्रांसफिकेशन डिसिंकक्शन का मूल्यांकन और मात्रा निर्धारित करने के लिए संवेदनशील संवेदनशील परीक्षण। एक एनएलएस-एनईएस-जीएफपी प्रोटीन (शटल-जीएफपी) के आयात की दर को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके वास्तविक समय में मापा जा सकता है। यह एक निर्यातिन अवरोधक का उपयोग किया जाता है, जैसा कि पहले 18 वर्णित है, इस प्रकार शटल-जीएफ़पी को केवल नाभिक में प्रवेश करने की इजाजत देता है। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और वास्तविक समय में फ्लोरोसेंट परिवर्तनों को मापने में सक्षम एक सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, यह नाभिक में स्थित शटल-जीएफपी की प्रतिदीप्ति तीव्रता में क्रमिक परिवर्तनों को मापना संभव है। नतीजतन, किसी भी समय पर परमाणु शटल-जीएफपी की मात्रा का प्रतिनिधित्व करने वाली प्रतिदीप्ति-टू-टाइम अक्ष का एक माइकलिस-मेन्टन-जैसी संतृप्ति वक्र, बनाया जा सकता है। घटता की प्रारंभिक रैखिक दर का उपयोग करके, एक ढलान उत्पन्न करना संभव है, जो प्रतिदीप्ति संतृप्ति से पहले नाभिक में प्रवेश की दर को दर्शाता है। परख को मान्य करने के लिए, अनुवादडी C9orf72 dipeptide दोहराता है, पाली (जीआर) और पाली (पीआर), जो पहले न्यूक्लूसोप्लास्मिक परिवहन को बाधित करने के लिए सूचित किया गया था, 5 , 7 , 8 , 10 , 12 का इस्तेमाल किया गया था। इस परख का उपयोग, नियंत्रण की तुलना में परमाणु आयात दर में 50% कमी देखी गई। इस प्रणाली का उपयोग करना, न्यूक्लूसोप्लास्मेक परिवहन में मिनट के परिवर्तन की जांच हो सकती है। इसके अलावा, एक न्युक्लोकॉस्प्टोस्मेस्की परिवहन दोष को बचाव करने के लिए विभिन्न कारकों की क्षमता निर्धारित की जा सकती है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34)</td>
			<td>tebu-bio</td>
			<td>CLU140-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 4.5g/L L-glucose</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-055-1A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS European Grade</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-007-1A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SL 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3111</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass 12mm dia. thick 0.13-0.17mm</td>
			<td>Bar Naor LTD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531">TurboFect Transfection Reagent</a></td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531">R0531</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 100 inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING WORKBENCH 2&#160;</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptomycin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2913</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>02-023-1A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer motor/control/chuck/90-degree clamp</td>
			<td>Glas-Col</td>
			<td>099C K5424CE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002455</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay to measure nucleocytoplasmic transport in real time within motor neuron-like nsc-34 cells

न्यूक्लोकोसाइटोप्लास्मिक परिवहन सेल नाभिक से बड़े अणुओं के आयात और निर्यात को संदर्भित करता है। हाल ही में, कई अध्ययनों में एमीयोथ्रोफिक पार्श्व स्केलेरोसिस (एएलएस) और न्यूक्लोकोसाइटोप्लास्मेक मार्ग में हानि के बीच एक कनेक्शन दिखाया गया है। एएलएस मोटर न्यूरॉन्स को प्रभावित करने वाली एक neurodegenerative रोग है और जिसके परिणामस्वरूप पक्षाघात और अंततः मृत्यु में, औसतन 2-5 वर्षों के भीतर। ए एल एस के अधिकांश मामलों छिटपुट हैं, जो किसी भी स्पष्ट आनुवंशिक संबंध की कमी है, लेकिन 10% एक प्रभावी तरीके से विरासत में मिला है। हाल ही में, क्रोमोज़म 9 खुले पढ़ने के फ्रेम 72 (सी 9orf72) जीन में हेक्सान्यूक्लियोटाइड दोहराए विस्तार (एचआरई) की पहचान एएलएस और फ्रंटोटेमपोरल डिमेंशिया (एफटीडी) के आनुवंशिक कारण के रूप में की गई थी। महत्वपूर्ण रूप से, विभिन्न समूहों ने हाल ही में प्रस्तावित किया है कि ये म्यूटेंट न्यूक्लूसोसाइटोप्लास्मिक परिवहन को प्रभावित करते हैं। इन अध्ययनों में ज्यादातर न्यूक्लूसोप्लास्मेक परिवहन पर एचआरई की वजह से अंतिम परिणाम और अभिव्यक्तियों को दिखाया गया है, लेकिन वे परमाणु परिवहन संबंधी समस्या का प्रदर्शन नहीं करते हैंरियल टाइम। नतीजतन, केवल गंभीर न्यूक्लोकोसाइटोप्लास्मिक परिवहन की कमी का निर्धारण किया जा सकता है, अधिकतर उच्च ओवर एक्सप्रेसन या बहिर्जात प्रोटीन प्रविष्टि के कारण। यह प्रोटोकॉल वास्तविक समय में न्यूक्लोकॉस्प्टोस्लॉजिकिक ट्रांसफिकेशन डिस्फ़क्शन के मूल्यांकन और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक नया और बहुत ही संवेदनशील परख का वर्णन करता है। एक एनएलएस-एनईएस-जीएफपी प्रोटीन (शटल-जीएफपी) के आयात की दर को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके वास्तविक समय में मापा जा सकता है। यह एक निर्यातिन अवरोधक का उपयोग करके किया जाता है, जिससे शटल जीएफपी केवल नाभिक में प्रवेश करने की अनुमति देता है। परख को मान्य करने के लिए, C9orf72 एचआरई अनुवादित दोहराव दोहराता है, पाली (जीआर) और पाली (पीआर), जो पहले से न्यूक्लियोकॉप्टोस्लैमिक परिवहन को बाधित करने के लिए दिखाया गया था, का उपयोग किया गया था। वर्णित परख का उपयोग, नियंत्रण की तुलना में परमाणु आयात दर में 50% कमी देखी गई। इस प्रणाली का उपयोग करते हुए, न्यूक्लूसोप्टोस्लैमिक परिवहन में मिनट के परिवर्तन की जांच की जा सकती है और विभिन्न कारकों की क्षमता (यहां तक ​​कि आंशिक रूप से) एक न्यूक्लियोक्साइटप्लास्मिक ट्रAnsport दोष निर्धारित किया जा सकता है

यहां प्रस्तुत प्रक्रिया का उपयोग करना, मोटर न्यूरॉन जैसी एनएससी -34 कोशिकाओं को एनएलएस-एनईएस-जीएफपी (शटल-जीएफपी) प्रोटीन के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था यह प्रोटीन, जिसमें एनएलएस और एनईएस स?...

Watch this Scientific Journal Video about Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells at JoVE.com

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

यह प्रोटोकॉल एक एनएलएस-एनईएस-जीएफ़पी प्रोटीन के परमाणु आयात में वास्तविक समय में बदलाव को बढ़ाकर मोटर न्यूरॉन जैसी एनएससी -34 कोशिकाओं के भीतर न्यूक्लूसियोप्लास्मिस्टिक ट्रांसपोर्ट रेट को संवेदनशील तरीके से मापने के लिए एक विधि का वर्णन करता है।

मोटर न्यूरॉन की तरह एनएससी -34 कक्षों के अंदर रीयल टाइम में न्यूक्लूसियोप्लास्मेक ट्रांसपोर्ट को मापने के लिए परख

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

The overall goal of this assay is to detect minute changes in the nucleocytoplasmic transport rate of cells in real time in the absence or presence of potential transport rate-suppressive molecules. This method can help answer key questions about specific neurogenetic diseases such as ALS, that have been proposed to negatively impact nucleocytoplasmic transport. Some advantages of this technique are that it is highly sensitive and quantitative and that it allows the real-time analysis of minute changes in the nucleocytoplasmic transport rate.Demonstrating the procedure will be Tom Shani, a graduate student from my laboratory. Begin by thawing approximately one times 10 to the sixth mouse neuroblastoma spinal cord cells from liquid nitrogen storage in a 37 degree Celsius water bath. When the cells are fully thawed, collect them by centrifugation, and resuspend the pellet in one milliliter of fresh medium.Then transfer the cells into 15-milliliter flask containing five milliliters of cell culture medium for an overnight incubation at 37 degrees Celsius in 5%carbon dioxide. When the cells reach 90%confluency, place eight uncoated cover slips into individual 60-millimeter culture dishes and sterilize the cover slips with 70%ethanol. Dry the cover slips under a UV light for 30 minutes.When the glass is dry, wash the cover slips with fresh medium to remove the residual ethanol. When the cover slips are ready, dissociate the neuroblastoma cells with trypsin-EDTA for about 15 seconds in the cell culture incubator. Then rest the sells for one minute at room temperature.Collect the cells by centrifugation. After counting, resuspend the pellet at a 3.5 times 10 to the fifth cells per three milliliters of medium concentration and seed three milliliters of cells per dish. Then place the cultures in the incubator for 24 hours to allow the cells to attach to the cover slips.The next day, add two micrograms of each transfection plasmid to one sterile microcentrifuge tube containing 300 microliters of DMEM medium per 60-millimeter culture dish. Add four microliters of commercial transfection reagent per two micrograms of plasmid to each tube. And vortex the DNA transfection solutions.Alternatively in cell populations where the shuttle-GFP nucleus to cytoplasmid ratio is close to a one-to-one ratio, the cells can be pre-labeled with a nuclear marker prior to their transfection to facilitate nuclear distinction. After a 25 minute incubation at room temperature, add the plasmids to each dish. And gently stir to obtain a homogenous solution.Return the cultures to the incubator for another 48 hours. Then attach the coverslips to a coverslip holder for a gentle PBS wash to remove any detached dead cells. Next place the coverslip under an inverted microscope and identify a patch of 20 to 30 GFP-expressing cells in which the nuclei are clearly defined.Use the imaging software to mark the nuclei within the patch. Then add 200 microliters of exportin-1 inhibitor leptomycin B buffer dropwise to the coverslip and quantify the fluorescence intensity of the marked nuclei in three-second intervals for around 400 to 500 seconds. After all the cover slips have been imaged, normalize the fluorescence intensity of each cell nuclei and generate a fluorescence intensity curve representing the changes in nuclear fluorescence as a function of time for each cell patch.Then analyze the maximum reaction velocity of the slope of each cell patch derived from three to five independent experiments to generate one slope per experimental group. For protein expression validation 48 hours after transfection, place the culture dishes on ice and wash the cells two times with PBS. Treat the cells in each dish with 200 to 400 microliters of lysis buffer.And use a cell scraper to remove the cells from the cover slips. Transfer the detached cells from each plate into individual microcentrifuge tubes. And further dissociate the cells with a homogenizer under ice.After one minute, pellet the homogenized cell pieces by centrifugation and measure the protein concentration in each supernatant by Bradford assay. Then pool 30 to 70 micrograms of protein per group into new microcentrifuge tubes. Store the tubes negative 20 degrees Celsius until SDS page protein expression analysis.Generic GFP can enter or exit the cell nucleus in the absence of a localization signal tag by diffusion only, resulting in an even distribution of the protein between the nucleus and the cytoplasm. In contrast, shuttle-GFP protein is mostly observed in the cytoplasm due to the nuclear export and nuclear localization signals directing its dispersion. Treatment with leptomycin B, a GFP protein export inhibitor, induces the accumulation of shuttle-GFP within the nucleus, allowing the shuttle-GFP import rate to be measured.These changes in the nuclear fluorescence intensity in the absence or presence of protein export inhibition can then be quantified in real time to assess the nuclear cytoplasmic transport rate of the shuttle-GFP overtime. To confirm that the activity of nucleolar stress-inducing dipeptide repeat proteins is not affected by protein export inhibition GFP, GFP-tagged dipeptide repeat proteins were visualized by fluorescence microscopy after leptomycin B treatment revealing poly(PR)expression in the nucleus as inclusions only, excluding the possibility of the generation of a false positive nuclear import signal. Poly(GR)expression however was observed homogenously in the cytosol and as inclusions within the nucleus.Indeed, neuroblastoma spinal cord cell transfection with poly(GR)only followed by leptmycin B treatment results in no observed shuttle movement of the expressed poly(GR)Further analysis of the nuclear cytoplasmic shuttle-GFP transport rate reveals the singular expression of either poly(PR)or poly(GR)dipeptide repeats indicating an about 50%decrease in the total nuclear import rate compared to control empty plasmid-transfected cells. We first had the idea for this method when we tried to find the quantitative assay for detecting small changes in nucleocytoplasmic dysfunction in real time. Once mastered, the microscopic analysis of the cells can be performed in approximately 10 minutes per coverslip.The data analysis for each coverslip can be completed in a few minutes. After its development, this technique paves the way for researchers in the field of neurodegenerative diseases to explore defects in nucleocytoplasmic transport using cellular models. After watching this video, you should have a good understanding of how to detect and quantify minute changes in cellular nucleocytoplasmic transport rate in real time.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

मोटर तंत्रिका transection और लाइव Zebrafish में Glial सेल व्यवहार के समय चूक इमेजिंग

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Using Informational Connectivity to Measure the Synchronous Emergence of fMRI Multi-voxel Information Across Time

समय के पार fMRI बहु voxel सूचना के तुल्यकालिक उभार उपाय करने के लिए सूचनात्मक कनेक्टिविटी का उपयोग

It is now appreciated that condition-relevant information can be present within distributed patterns of functional magnetic resonance imaging (fMRI) brain ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

क्वांटम के Axonal परिवहन की वास्तविक समय इमेजिंग प्राथमिक न्यूरॉन्स में BDNF डॉट लेबल

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

एक<em&gt; पूर्व vivo</em&gt; लेजर प्रेरित स्पाइनल कॉर्ड चोट मॉडल वास्तविक समय में axonal अध: पतन के तंत्र का आकलन करने के लिए

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

वास्तविक समय इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी: जांच Neuronal गतिशीलता और परे करने के लिए बंद लूप प्रोटोकॉल का उपयोग

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

रीयल-टाइम Iontophoresis Tetramethylammonium के साथ मात्रा मात्रा और ब्रेन एक्स्ट्रासेल्यूलर स्पेस के Tortuosity मात्रा

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

लाइव-एक वास्तविक समय शिविर परख का उपयोग कर गंध रिसेप्टर सक्रियण के सेल माप

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

उच्च सामग्री के लिए परख विकास Sod1 उत्परिवर्ती प्रोटीन समग्र गठन के रहने की कोशिकाओं में ठहराव

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

माइक्रोफ्लूइडिक चैम्बर्स सिस्टम का उपयोग करके मोटर न्यूरॉन संस्कृतियों में ऑर्गेनेल्स का एक्सोनल परिवहन

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Real-Time fMRI Brain Mapping in Animals

जानवरों में रियल-टाइम एफएमआरआई ब्रेन मैपिंग

Dynamic fMRI responses vary largely according to the physiological conditions of animals either under anesthesia or in awake states. We developed a ...