Name: assay to measure nucleocytoplasmic transport in real time within motor neuron-like nsc-34 cells
Uploaded: 2017-05-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells at JoVE.com

AIラボのメンバー全員に、有益なご意見とご提案をいただき、ありがとうございます。私たちはシャトル-GFPベクターを提供してくれたMark Hipp教授（Max Planck生化学研究所）に感謝します。この作業は、イスラエル科学財団（ISF＃124/14）、Binational Science Foundation（BSF＃2013325）、FP7 Marie Curie Career Integration Grant（CIG＃333794）、イスラエルの精神生物学研究所NIPI＃b133-14 / 15）。

1.細胞株の調製<ol><li>液体窒素容器に保存されたマウス神経芽細胞腫脊髄細胞（NSC-34細胞）を約1,000,000個解凍。細胞が完全に解凍するまで、37°C​​の水インキュベーターを使用してください。 </li><li>新鮮な暖かい培地（10％ウシ胎仔血清（FBS）、1％L-グルタミン、および1％ペン - ストレプト系抗生物質を含むDMEM培地）を加える。 </li><li>解凍した細胞（SL16R）を500×gで5分間遠心分離し、細?...

<ol>
	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (2002).</li><li>Freitas, N., Cunha, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+signals+for+the+nuclear+import+of+proteins.">Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins.</a> Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).</li><li>Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short+amino+acid+sequence+able+to+specify+nuclear+location.">A short amino acid sequence able to specify nuclear location.</a> Cell. 39, 499-509 (1984).</li><li>la Cour, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+prediction+of+leucine-rich+nuclear+export+signals.">Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals.</a> Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS/FTD.">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Sci Rep. 6, 20877 (2016).</li><li>Freibaum, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GGGGCC+repeat+expansion+in+C9orf72+compromises+nucleocytoplasmic+transport.">GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 129-133 (2015).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).</li><li>Kwon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeats+bind+nucleoli,+impede+RNA+biogenesis,+and+kill+cells.">Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells.</a> Science. 345, 1139-1145 (2014).</li><li>Rossi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+accumulation+of+mRNAs+underlies+G4C2-repeat-induced+translational+repression+in+a+cellular+model+of+C9orf72+ALS.">Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS.</a> J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).</li><li>Shi, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+PRn+poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeat+expansion+block+nuclear+import+and+export.">Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C9orf72+repeat+expansion+disrupts+nucleocytoplasmic+transport.">The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 56-61 (2015).</li><li>Zhang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9ORF72+poly(GA)+aggregates+sequester+and+impair+HR23+and+nucleocytoplasmic+transport+proteins.">C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins.</a> Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).</li><li>Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Charcot+to+Lou+Gehrig:+deciphering+selective+motor+neuron+death+in+ALS.">From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).</li><li>DeJesus-Hernandez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+GGGGCC+hexanucleotide+repeat+in+noncoding+region+of+C9ORF72+causes+chromosome+9p-linked+FTD+and+ALS.">Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS.</a> Neuron. 72, 245-256 (2011).</li><li>Renton, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hexanucleotide+repeat+expansion+in+C9ORF72+is+the+cause+of+chromosome+9p21-linked+ALS-FTD.">A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD.</a> Neuron. 72, 257-268 (2011).</li><li>Boeve, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+frontotemporal+dementia+and/or+amyotrophic+lateral+sclerosis+associated+with+the+GGGGCC+repeat+expansion+in+C9ORF72.">Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72.</a> Brain. 135, 765-783 (2012).</li><li>Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+biology+of+the+C9orf72+nucleotide+repeat+expansion+in+neurodegenerative+disease.">The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease.</a> Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).</li><li>Woerner, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+aggregates+interfere+with+nucleocytoplasmic+transport+of+protein+and+RNA.">Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA.</a> Science. 351, 173-176 (2016).</li><li>Tao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+stress+and+impaired+stress+granule+formation+contribute+to+C9orf72+RAN+translation-induced+cytotoxicity.">Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity.</a> Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).</li><li>Wen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+proline-arginine+RAN+dipeptides+linked+to+C9ORF72-ALS/FTD+form+toxic+nuclear+aggregates+that+initiate+in+vitro+and+in+vivo+neuronal+death.">Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death.</a> Neuron. 84, 1213-1225 (2014).</li></ol>

このプロトコールは、核細胞質輸送における微小変化を評価するための、高感度かつ定量的な新しいアッセイを実証している。このシステムを使用すると、蛋白質の分布に劇的な変化をもたらす大きな欠損だけでなく、リアルタイムで核細胞質輸送およびその機能不全を観察および測定することが可能である。このアッセイは、感度優位性を有するばかりでなく、調製もほとんど必要とせず?...

核細孔複合体（NPC）は、細胞核に出入りする大分子の輸出入を制御する。第1規則なしで核に入ることができる小分子とは対照的に、より大きな分子の輸送はNPCによって強く制御される。タンパク質やRNAなどのこれらの大きな分子は、輸入や輸出を含む輸送要因と関連して核2から輸入され、輸出されます2 。輸入するためには、蛋白質には、一般に核局在化シグナル（NLS）と呼ばれる小さなペプチドモチーフが含まれていなければならない。これらのアミノ酸配列はタグとして作用し、組成物3,4 において多様である。タンパク質は、それらのエクスポージャーとの関連性のために、核から細胞質に輸出することができる一般に核輸出シグナル（NES） 2と呼ばれるシグナル配列に結合する。輸入業者と輸出業者の両方は、小型Ras関連核タンパク質GTPアーゼ（Ran） 2の調節のために貨物を輸送することができる。 Ranは、それがGTPまたはGDPに結合しているかどうかによって、異なる立体構造状態で存在することが示されている。 GTPに結合すると、Ranはimportinまたはexportinにバインドできます。 RanGTPに結合すると、インポートインはそれらの貨物を放出するが、輸出はRanGTPに結合して輸出貨物と複合体を形成しなければならない。 Ranの優勢なヌクレオチド結合状態は、核（RanGTP）または細胞質（RanGDP）におけるその位置に依存する。 最近、いくつかの研究が、核細胞質経路の障害と筋萎縮性側索硬化症（ALS）および前頭側頭型痴呆（FTD）の両方の間の関連を示している5,6 </sup&gt; 、 7、8、9、10、11、12 。 ALSは、上下運動ニューロン（MN） 13に影響を及ぼし、麻痺をもたらし、最終的には死亡し、平均で2〜5年以内に進行する致死的な神経変性疾患である。 ALSのほとんどの症例は散発性（SALS）と分類され、明らかな遺伝的連鎖はないが、10％が優性遺伝（家族性ALS; FALS）で遺伝する。最近、ALSおよびFTDの遺伝的原因として、第9染色体のオープンリーディングフレーム72（C9orf72）遺伝子におけるヘキサヌクレオチド反復増幅（HRE）が14,15であることが同定された。これらの突然変異体は、FALS症例の30〜40％を占め、異なる研究が争われているそれらが核細胞質輸送5,6,7,8,9,10,11,12に影響を及ぼすことによって毒性を引き起こすことを示している。 これらの研究は、核細胞質輸送に関するHREの最終的な結果および発現をほとんど示しているが、リアルタイムで核細胞質崩壊を示さない。その結果、重度の核細胞質輸送の欠損のみが評価された11,17,18。 このプロトコルは、新しいとveリアルタイムで核細胞輸送機能不全を評価および定量するためのry感受性アッセイ。 NLS-NES-GFPタンパク質（シャトル-GFP）の輸入率は、蛍光顕微鏡を用いてリアルタイムで定量することができる。これは、以前に記載されているように、exportinインヒビターを用いて行われ、シャトル-GFPのみが核に入ることを可能にする。蛍光顕微鏡およびリアルタイムで蛍光変化を定量化することができるソフトウェアを使用して、核内に位置するシャトル-GFPの蛍光強度の段階的変化を定量化することが可能である。結果として、任意の所与の時間における核シャトル-GFPの量を表す、蛍光対時間軸のミカエリス - メンテン様の飽和曲線を作成することができる。曲線の初期線形速度を用いることにより、蛍光飽和前に核への進入速度を表す勾配を生成することが可能である。 アッセイを検証するために、翻訳以前に核細胞質輸送を破壊すると報告されているd C9orf72ジペプチドリピート、ポリ（GR）およびポリ（PR）を5,7,8,10,12で使用した。このアッセイを用いて、対照と比較して核の輸入率の50％の減少が観察された。このシステムを用いて、核細胞質輸送の微小な変化を調べることができる。さらに、核細胞質輸送欠陥を救済する異なる因子の能力を決定することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34)</td>
			<td>tebu-bio</td>
			<td>CLU140-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 4.5g/L L-glucose</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-055-1A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS European Grade</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-007-1A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SL 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3111</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass 12mm dia. thick 0.13-0.17mm</td>
			<td>Bar Naor LTD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531">TurboFect Transfection Reagent</a></td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531">R0531</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 100 inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING WORKBENCH 2&#160;</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptomycin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2913</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>02-023-1A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer motor/control/chuck/90-degree clamp</td>
			<td>Glas-Col</td>
			<td>099C K5424CE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002455</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay to measure nucleocytoplasmic transport in real time within motor neuron-like nsc-34 cells

核細胞質輸送は、細胞核からの大きな分子の輸入および輸出を指す。最近、多くの研究が、筋萎縮性側索硬化症（ALS）と核細胞質経路における障害との関連を示している。 ALSは、運動ニューロンに影響を及ぼし、麻痺をもたらし、最終的には死亡し、2〜5年以内に平均して起こる神経変性疾患である。 ALSのほとんどの症例は散発的であり、明らかな遺伝的連鎖を欠いているが、10％が優勢に遺伝する。最近、第9染色体のオープンリーディングフレーム72（C9orf72）遺伝子におけるヘキサヌクレオチド反復増幅（HRE）が、ALSおよび前頭側頭型痴呆（FTD）の遺伝的原因として同定された。重要なことに、異なるグループは最近、これらの突然変異体が核細胞質輸送に影響を及ぼすことを提案している。これらの研究は、核細胞質輸送に関するHREによって引き起こされる最終的な結果および徴候をほとんど示しているが、核内輸送機能障害を示さないリアルタイム。結果として、重度の核細胞質輸送の欠損のみが、主に高過剰発現または外因性タンパク質挿入のために決定され得る。 このプロトコルは、リアルタイムでnucleocytoplasmic輸送機能不全を評価し定量化するための新しい非常に敏感なアッセイを記述します。 NLS-NES-GFPタンパク質（シャトル-GFP）の輸入率は、蛍光顕微鏡を用いてリアルタイムで定量することができる。これは、exportinインヒビターを用いて行われ、シャトルGFPのみが核に入ることを可能にする。アッセイを有効にするために、以前に核細胞質輸送を破壊することが示されているC9orf72 HRE翻訳ジペプチドリピート、ポリ（GR）およびポリ（PR）を使用した。記載されたアッセイを用いて、対照と比較して核輸入率の50％の減少が観察された。このシステムを用いて、核細胞質輸送の微小な変化を調べることができ、異なる因子が核細胞質trを（部分的に）救済する能力欠陥を判定することができる。

ここに示した手順を用いて、運動ニューロン様NSC-34細胞を、NLS-NES-GFP（シャトル-GFP）タンパク質でトランスフェクトした。 NLSおよびNESシグナル配列を有するこのタンパク質（ 図1 ）は、核と細胞質との間を行き来することができる。一般的なGFPは、拡散によってのみ局在化シグナルタグが存在しない場合に核に出入りすることができ、従って、核と細胞?...

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Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

このプロトコルは、NLS-NES-GFPタンパク質の核内取り込みにおけるリアルタイム変化を定量化することにより、運動ニューロン様NSC-34細胞内の核細胞質輸送速度を敏感に測定する方法を記載する。

運動ニューロン様NSC-34細胞内のリアルタイムでの核細胞質輸送を測定するアッセイ

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

The overall goal of this assay is to detect minute changes in the nucleocytoplasmic transport rate of cells in real time in the absence or presence of potential transport rate-suppressive molecules. This method can help answer key questions about specific neurogenetic diseases such as ALS, that have been proposed to negatively impact nucleocytoplasmic transport. Some advantages of this technique are that it is highly sensitive and quantitative and that it allows the real-time analysis of minute changes in the nucleocytoplasmic transport rate.Demonstrating the procedure will be Tom Shani, a graduate student from my laboratory. Begin by thawing approximately one times 10 to the sixth mouse neuroblastoma spinal cord cells from liquid nitrogen storage in a 37 degree Celsius water bath. When the cells are fully thawed, collect them by centrifugation, and resuspend the pellet in one milliliter of fresh medium.Then transfer the cells into 15-milliliter flask containing five milliliters of cell culture medium for an overnight incubation at 37 degrees Celsius in 5%carbon dioxide. When the cells reach 90%confluency, place eight uncoated cover slips into individual 60-millimeter culture dishes and sterilize the cover slips with 70%ethanol. Dry the cover slips under a UV light for 30 minutes.When the glass is dry, wash the cover slips with fresh medium to remove the residual ethanol. When the cover slips are ready, dissociate the neuroblastoma cells with trypsin-EDTA for about 15 seconds in the cell culture incubator. Then rest the sells for one minute at room temperature.Collect the cells by centrifugation. After counting, resuspend the pellet at a 3.5 times 10 to the fifth cells per three milliliters of medium concentration and seed three milliliters of cells per dish. Then place the cultures in the incubator for 24 hours to allow the cells to attach to the cover slips.The next day, add two micrograms of each transfection plasmid to one sterile microcentrifuge tube containing 300 microliters of DMEM medium per 60-millimeter culture dish. Add four microliters of commercial transfection reagent per two micrograms of plasmid to each tube. And vortex the DNA transfection solutions.Alternatively in cell populations where the shuttle-GFP nucleus to cytoplasmid ratio is close to a one-to-one ratio, the cells can be pre-labeled with a nuclear marker prior to their transfection to facilitate nuclear distinction. After a 25 minute incubation at room temperature, add the plasmids to each dish. And gently stir to obtain a homogenous solution.Return the cultures to the incubator for another 48 hours. Then attach the coverslips to a coverslip holder for a gentle PBS wash to remove any detached dead cells. Next place the coverslip under an inverted microscope and identify a patch of 20 to 30 GFP-expressing cells in which the nuclei are clearly defined.Use the imaging software to mark the nuclei within the patch. Then add 200 microliters of exportin-1 inhibitor leptomycin B buffer dropwise to the coverslip and quantify the fluorescence intensity of the marked nuclei in three-second intervals for around 400 to 500 seconds. After all the cover slips have been imaged, normalize the fluorescence intensity of each cell nuclei and generate a fluorescence intensity curve representing the changes in nuclear fluorescence as a function of time for each cell patch.Then analyze the maximum reaction velocity of the slope of each cell patch derived from three to five independent experiments to generate one slope per experimental group. For protein expression validation 48 hours after transfection, place the culture dishes on ice and wash the cells two times with PBS. Treat the cells in each dish with 200 to 400 microliters of lysis buffer.And use a cell scraper to remove the cells from the cover slips. Transfer the detached cells from each plate into individual microcentrifuge tubes. And further dissociate the cells with a homogenizer under ice.After one minute, pellet the homogenized cell pieces by centrifugation and measure the protein concentration in each supernatant by Bradford assay. Then pool 30 to 70 micrograms of protein per group into new microcentrifuge tubes. Store the tubes negative 20 degrees Celsius until SDS page protein expression analysis.Generic GFP can enter or exit the cell nucleus in the absence of a localization signal tag by diffusion only, resulting in an even distribution of the protein between the nucleus and the cytoplasm. In contrast, shuttle-GFP protein is mostly observed in the cytoplasm due to the nuclear export and nuclear localization signals directing its dispersion. Treatment with leptomycin B, a GFP protein export inhibitor, induces the accumulation of shuttle-GFP within the nucleus, allowing the shuttle-GFP import rate to be measured.These changes in the nuclear fluorescence intensity in the absence or presence of protein export inhibition can then be quantified in real time to assess the nuclear cytoplasmic transport rate of the shuttle-GFP overtime. To confirm that the activity of nucleolar stress-inducing dipeptide repeat proteins is not affected by protein export inhibition GFP, GFP-tagged dipeptide repeat proteins were visualized by fluorescence microscopy after leptomycin B treatment revealing poly(PR)expression in the nucleus as inclusions only, excluding the possibility of the generation of a false positive nuclear import signal. Poly(GR)expression however was observed homogenously in the cytosol and as inclusions within the nucleus.Indeed, neuroblastoma spinal cord cell transfection with poly(GR)only followed by leptmycin B treatment results in no observed shuttle movement of the expressed poly(GR)Further analysis of the nuclear cytoplasmic shuttle-GFP transport rate reveals the singular expression of either poly(PR)or poly(GR)dipeptide repeats indicating an about 50%decrease in the total nuclear import rate compared to control empty plasmid-transfected cells. We first had the idea for this method when we tried to find the quantitative assay for detecting small changes in nucleocytoplasmic dysfunction in real time. Once mastered, the microscopic analysis of the cells can be performed in approximately 10 minutes per coverslip.The data analysis for each coverslip can be completed in a few minutes. After its development, this technique paves the way for researchers in the field of neurodegenerative diseases to explore defects in nucleocytoplasmic transport using cellular models. After watching this video, you should have a good understanding of how to detect and quantify minute changes in cellular nucleocytoplasmic transport rate in real time.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

モーター神経切断とライブゼブラフィッシュにおけるグリア細胞の挙動のタイムラプスイメージング

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

神経科学

Using Informational Connectivity to Measure the Synchronous Emergence of fMRI Multi-voxel Information Across Time

時間を越えてのfMRI多ボクセル情報の同期出現を測定するために情報を使用した接続

It is now appreciated that condition-relevant information can be present within distributed patterns of functional magnetic resonance imaging (fMRI) brain ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

一次ニューロンにおける量子ドットで標識されたBDNFの軸索輸送のリアルタイムイメージング

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

アン<em&gt;エクスビボ</em&gt;レーザー誘起脊髄損傷モデルがリアルタイムで軸索変性のメカニズムを評価するために

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

リアルタイム電気生理学：プローブ神経ダイナミクスとその先にクローズド·ループ·プロトコルの使用

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

脳の細胞外空間の体積分率とねじれを定量するためのテトラメチルアンモニウムによるリアルタイムイオントフォレシス

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

生細胞測定の嗅覚受容体活性化アッセイを用いた、リアルタイム キャンプ

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

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Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

マイクロ流体室システムを用いた運動ニューロン培養におけるオルガネラの軸索輸送

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Real-Time fMRI Brain Mapping in Animals

動物におけるリアルタイムfMRI脳マッピング

Dynamic fMRI responses vary largely according to the physiological conditions of animals either under anesthesia or in awake states. We developed a ...