Name: detection and visualization of dna damage-induced protein complexes in suspension cell cultures using the proximity ligation assay
Uploaded: 2017-06-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Forskning i Guikema laboratoriet finansieres af Innovationsforskningsincentiverne fra Den Hollandske Organisation for Videnskabelig Forskning (VIDI-bevilling 016126355) og Stichting Kinderen Kankervrij KiKA (projekt 252).

1. Behandling af celler og DNA-skadeinduktion <ol><li> Kultur de humane BCR-ABL + B-celle-akutte lymfoblastiske cellelinier BV173 eller SUP-B15 i IMDM suppleret med 20% FCS, 50 μM p-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin ved 37 ° C i en atmosfære på 5% CO2. Tæl celler og plade ved 2 x 106 celler / ml i 6-brøndsplader ved 5 ml / brønd. BEMÆRK: Suspension cellelinjer af forskellig oprindelse kan eventuelt anvendes. </li><li> For at arrestere...

<ol>
	<li>Mar&#233;chal, A., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage+Sensing+by+the+ATM+and+ATR+Kinases.">DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716 (2013).</li><li>Huen, M. S. Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+checkpoint+and+repair+machineries+at+DNA+damage+sites.">Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites.</a> Trends Biochem Sci. 35 (2), 101-108 (2010).</li><li>Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+function+of+DNA+double-strand+break+repair+foci+in+mammalian+cells.">Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells.</a> DNA Repair. 9 (12), 1219-1228 (2010).</li><li>Matsuoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+and+ATR+substrate+analysis+reveals+extensive+protein+networks+responsive+to+DNA+damage.">ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage.</a> Science. 316 (5828), 1160-1166 (2007).</li><li>Barlow, C., Brown, K. D., Deng, C. X., Tagle, D. A., Wynshaw-Boris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atm+selectively+regulates+distinct+p53-dependent+cell-cycle+checkpoint+and+apoptotic+pathways.">Atm selectively regulates distinct p53-dependent cell-cycle checkpoint and apoptotic pathways.</a> Nature Genet. 17 (4), 453-456 (1997).</li><li>Tibbetts, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+ATR+in+the+DNA+damage-induced+phosphorylation+of+p53.">A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53.</a> Genes Dev. 13 (2), 152-157 (1999).</li><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+Multicolor+Imaging+of+the+Nuclear+Periphery+with+3D+Structured+Illumination+Microscopy.">Subdiffraction Multicolor Imaging of the Nuclear Periphery with 3D Structured Illumination Microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li><li>Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1-associated+exclusion+of+53BP1+from+DNA+damage+sites+underlies+temporal+control+of+DNA+repair.">BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 15), 3529-3534 (2012).</li><li>Gullberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sense+of+closeness:+protein+detection+by+proximity+ligation.">A sense of closeness: protein detection by proximity ligation.</a> Curr Opin Biotechnol. 14 (1), 82-86 (2003).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li><li>Dong, Y., Shannon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+immunosensing+using+antigen+and+antibody+monolayers+on+gold+surfaces+with+electrochemical+and+scanning+probe+detection.">Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surfaces with electrochemical and scanning probe detection.</a> Anal Chem. 72 (11), 2371-2376 (2000).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li><li>Economopoulou, P., Pappa, V., Papageorgiou, S., Dervenoulas, J., Economopoulos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormalities+of+DNA+repair+mechanisms+in+common+hematological+malignancies.">Abnormalities of DNA repair mechanisms in common hematological malignancies.</a> Leuk Lymphoma. 52 (4), 567-582 (2011).</li><li>Rendleman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+DNA+repair+pathways+and+risk+of+non-Hodgkin's+lymphoma.">Genetic variation in DNA repair pathways and risk of non-Hodgkin's lymphoma.</a> PloS One. 9 (7), e101685 (2014).</li><li>Ochodnicka-Mackovicova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+Damage+Response+Regulates+RAG1/2+Expression+in+Pre-B+Cells+through+ATM-FOXO1+Signaling.">The DNA Damage Response Regulates RAG1/2 Expression in Pre-B Cells through ATM-FOXO1 Signaling.</a> J Immunol. , (2016).</li><li>Banin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+phosphorylation+of+p53+by+ATM+in+response+to+DNA+damage.">Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage.</a> Science. 281 (5383), 1674-1677 (1998).</li></ol>

I denne rapport er det påvist, at PLA kan anvendes til at bestemme og visualisere den specifikke interaktion mellem proteiner i suspensionscellekulturer. Bemærk, at den her beskrevne protokol ikke er begrænset til undersøgelsen af ​​DNA-reparationskomplekser, men også gælder for visualisering og kvantificering af andre protein-protein-interaktioner i suspensionscellekulturer. Det er vist at ATM-kinasen interagerer med phosphoryleret p53 i G1-arresterede BCR-ABL + B-ALL-celler, når de udsættes for et DNA-skad...

DNA-skader udløser en stærkt reguleret serie af hændelser, der involverer protein-protein-interaktioner og post-translationelle modifikationer, der sikrer effektiv og hurtig reparation af DNA, hvorved der sikres genomisk integritet 1 . Typisk bliver DNA-reparation undersøgt i celler udsat for ioniserende stråling ved at overvåge dannelsen af ​​såkaldt ioniserende strålingsinduceret foci (IRIF) ved (konfokal) fluorescensmikroskopi. Mange DNA-reparations- og DNA-skadesfølerproteiner danner IRIF&#39;er, som repræsenterer proteinkomplekser, der nucleerer ved chromatinsteder, der opretholder DNA-beskadigelse 2 , 3 . Placeringen og opløsningen af ​​IRIF&#39;er over tid giver et vigtigt indblik i spatiotemporal organisering af DNA-reparation og kan indikere involvering af forskellige DNA-reparationsveje. Arten af ​​DNA-beskadigelsen og cellecyklusfasen, hvor skaden er opnået, bestemmer hvilken DNA-reparationsvej der aktiveres. fo<html> For eksempel er homolog rekombination (HR) i celler, der er aktivt involveret i DNA-replikation (S-fase), den dominerende DNA-reparationsvej, hvorimod i celler i G1- eller G2 / M-fasen af ​​cellecyklussen, Homolog end-joining (NHEJ) reparationsvej dominerer. En af de tidligste hændelser, der følger med DNA-beskadigelse, er aktiveringen af ​​DNA-beskadigende kinaser Ataxia Telangiectasia-Mutated Protein (ATM), som hovedsagelig er aktiv i Cellecyklets G1- og G2 / M-faser og regulerer NHEJ, Og Ataxia Telangiectasia og Rad3-relateret protein (ATR), som virker i S-fase ved at aktivere HR. Både ATM og ATR er meget pleiotropiske kinaser, der phosphorylerer mange proteiner, der er involveret i DNA-reparation, celledød og overlevelse 4 . Begge kinaser har vist sig at phosphorylere og aktivere tumor-suppressorproteinet p53 efter eksponeringen for genotoksisk stress, hvilket indikerer, at disse kinaser er opstrøms mediatorer af en svingende tumorundertrykkende signalakse&quot;Xref&quot;&gt; 5 , 6 . Dannelsen og sammensætningen af ​​IRIF&#39;er vurderes typisk ved at bestemme co-lokalisering af forskellige proteiner ved anvendelse af dobbeltfarve immunofluorescensfarvning og mikroskopi, men ikke alle proteiner, som er en del af reparationsproteinkomplekser, danner IRIF&#39;er, hvilket begrænser anvendeligheden af ​​denne fremgangsmåde. Desuden er (konfokal) immunofluorescensmikroskopi begrænset af diffraktionsegenskaberne af lys, hvilket resulterer i en ret dårlig rumlig opløsning på ca. 200-300 nm, der overstiger størstedelen af ​​de fleste subcellulære strukturer, hvilket i det væsentlige forbyder direkte undersøgelse af protein-proteininteraktioner ved Det molekylære niveau. Som sådan er co-lokalisering af immunofluorescensfarvningsmønstre som detekteret af (konfokal) fluorescensmikroskopi ikke nødvendigvis indicative for direkte protein-protein-interaktioner. For nylig er der udviklet nye superopløsnings teknologier, såsom tredimensionelle strukturerTured illuminationsmikroskopi (3D-SIM) 7 , som med succes blev brugt til at studere 53BP1 og BRCA1 IRIF-dannelse ved nano-skala-detaljer, hvilket afslørede de rumlige fordelingsegenskaber for disse proteiner, som ikke kunne detekteres ved hjælp af konfokal laserscanningsmikroskopi 8 . Adskillige andre metoder kan anvendes til at detektere protein-protein-interaktioner in vivo , såsom co-immunopræcipitation, pull-down-metoder og gær-to-hybrid screeningsmetoder. Imidlertid er disse teknikker ret besværlige, kræver store mængder af celler eller proteiner eller involverer overekspression af proteiner, som introducerer eksperimentelle artefakter. For nylig er der udviklet en ny teknik, der muliggør visualisering og kvantificering af protein-protein-interaktioner in situ ( dvs. i celler og i væv), som kaldes Proximity Ligation Assay (PLA) 9 , 10 . prImary-antistoffer, som genkender to proteiner af interesse, detekteres af sekundære antistoffer, som er konjugeret til oligonukleotider (såkaldte PLA-prober). Hvis de to forskellige sekundære antistoffer er tilstrækkeligt tætte på grund af interaktioner mellem proteinerne genkendt af de primære antistoffer, hybridiserer de konjugerede oligonukleotider og kan ligeres til dannelse af et lukket cirkulært DNA-substrat. Dette cirkulære substrat amplificeres efterfølgende ved hjælp af rullende cirkelamplifikation og visualiseres med fluorochrom-konjugerede komplementære oligonukleotider. Ved anvendelse af PLA bevares den subcellulære lokalisering af protein-proteininteraktionen, idet det fluorescensmærkede rullecirkelforstærkelsesprodukt forbliver fastgjort til PLA-proberne. Opløsningen af ​​dette assay er &lt;50 nm, baseret på den konstatering, at diameteren af ​​et antistof er ca. 7-10 nm 11 . Rulcirkelforstærkning kan kun finde sted, hvis to par antistoffer (primær + seconDary) fysisk interagere inden for perimeteren, der er defineret af deres størrelse (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). Signalforstærkningstrinnet øger følsomheden af ​​PLA-analysen og muliggør detektion af interaktioner af knap udtrykte proteiner. PLA genererer punkterede, foci-lignende signaler, der kan kvantificeres pr. Cellebasis, hvormed den intra- og intercellulære variation i protein-protein-interaktioner kan vurderes. Dannelsen og sammensætningen af ​​DNA-reparationskomplekser og IRIF&#39;er studeres for det meste i adhærente cellelinjer, såsom den humane knogle osteosarkomepithelcellelinie U2OS, den humane embryonale nyrelinje HEK293 og den retinale pigmentepitelcellelinie RPE-1, som er hurtig- Voksende og let at transfektere. Suspension celle kulturer sådanne lymfoide og myeloid cellelinier anvendes mindre hyppigt, da disse er mindre modtagelige for transfektion og generelt ikke klæber til coverlips, hvilket således kræver yderligere / alternativ stEps til billedbehandling. Opløsningen af ​​DNA-beskadigelse er imidlertid meget relevant i forbindelse med lymfoide og myelide maligniteter, da DNA-skaderesponset ofte påvirkes af genomiske (driver) aberrationer i disse tumorer og spiller en afgørende rolle i den ondartede transformation af normal lymfoid og myeloid ( Stamceller) celler 12 , 13 , 14 . Denne protokol beskriver, hvordan PLA kan anvendes til at vurdere og kvantificere protein-proteininteraktioner efter induktionen af ​​DNA-beskadigelse i suspensionscellekulturer. Her udføres PLA for at bestemme og visualisere interaktionerne mellem ATM og p53 ved DNA-beskadigelse i humane B-celle-leukæmiceller, som induceres at gennemgå en G1-fase cellecyklusarrest. Bemærk, at protokollen, der præsenteres her, ikke er begrænset til at studere ATM- og p53-interaktioner i G1-arresterede leukæmiceller, men kan også anvendes til at visualisere andre protein-proteininterI forskellige celletyper og suspensionscellekulturer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BV173 cell line</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>AC-20</td>
			<td>BCR-ABL+ B-ALL cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUP-B15 cell line</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC-389</td>
			<td>BCR-ABL+ B-ALL cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>21980-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>lot #: 064M3396</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imatinib methanesulfonate</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>I-5508</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neocarzinostatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N9162</td>
			<td>Mutagenic/teratogenic, handle with care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KU55933</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1092</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starfrost Microscopy Slides</td>
			<td>Waldemar Knittel</td>
			<td>VA11200 003FKB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen liquid blocker</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin funnel</td>
			<td>Q Path Labonord SAS</td>
			<td>003411324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DUO92105</td>
			<td>Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat-anti-ATM</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-136A</td>
			<td>PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit-anti-phospho-Ser15-p53</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9284</td>
			<td>We succesfully used lot #9284-4 in our studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield antifading mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield antifading mounting medium</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde in PBS</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-281692</td>
			<td>Also available from various other vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and visualization of dna damage-induced protein complexes in suspension cell cultures using the proximity ligation assay

DNA-skaderesponset orkestrerer reparationen af ​​DNA-læsioner, som forekommer spontant, forårsages af genotoksisk stress eller forekommer i sammenhæng med programmerede DNA-pauser i lymfocytter. Ataxia-Telangiectasia-muteret kinase (ATM), ATM- og Rad3-beslægtet kinase (ATR) og den katalytiske underenhed af DNA-afhængig proteinkinase (DNA-PKcs) er blandt de første, der aktiveres ved induktion af DNA-beskadigelse og er Centrale regulatorer af et netværk, der styrer DNA-reparation, apoptose og celleoverlevelse. Som en del af en tumorundertrykkende vej aktiverer ATM og ATR p53 gennem phosphorylering og derved regulerer den transkriptionelle aktivitet af p53. DNA-beskadigelse resulterer også i dannelsen af ​​såkaldt ioniserende strålingsinduceret foci (IRIF), som repræsenterer komplekser af DNA-beskadigelsesføler og reparationsproteiner, der akkumulerer ved DNA-beskadigelsesstederne, som visualiseres ved fluorescensmikroskopi. Samlokalisering af proteiner i IRIF&#39;er indebærer imidlertid ikke nødvendigvis dIrect protein-proteininteraktioner, da opløsningen af ​​fluorescensmikroskopi er begrænset. In situ Proximity Ligation Assay (PLA) er en ny teknik, der muliggør direkte visualisering af protein-protein interaktioner i celler og væv med hidtil uset specificitet og følsomhed. Denne teknik er baseret på den rumlige nærhed af specifikke antistoffer, som binder til proteiner af interesse. Når de forhørte proteiner er inden for ~ 40 nm, udløses en amplifikationsreaktion af oligonukleotider, som er konjugeret til antistofferne, og amplifikationsproduktet visualiseres ved fluorescensmærkning, hvilket giver et signal, som svarer til den intercellulære placering af de interagerende proteiner. Ved hjælp af den etablerede funktionelle vekselvirkning mellem ATM og p53 som et eksempel, er det her vist, hvordan PLA kan anvendes i suspensionscellekulturer til at studere de direkte interaktioner mellem proteiner, som er integrerende dele af DNA-skaderesponsen.

Fosforylering af p53 ved rest Ser15 viste sig at være afhængig af ATM-kinaseaktivitet 16 . For at demonstrere og bekræfte specificiteten af ​​PLA-teknikken på cytospinpræparater af suspensionscellekulturer, er det vist, at induktion af DNA-beskadigelse ved 2 timers NCS-behandling af BCR-ABL + B-ALL-celler arresteret i G1-fasen af ​​cellecyklussen Resulterede i den specifikke interaktion mellem ATM og phospho-Ser15-p53 som forventet. Punctate PLA-signa...

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Her er det demonstreret, hvordan in situ Proximity Ligation Assay (PLA) kan anvendes til at detektere og visualisere de direkte protein-proteininteraktioner mellem ATM og p53 i suspensionscellekulturer udsat for genotoksisk stress.

Påvisning og visualisering af DNA-skader-inducerede proteinkomplekser i suspensionscellekulturer ved anvendelse af Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualisering af protein-protein interaktion i nukleare og Cytoplasmiske Brøker af Co-immunopræcipitation og<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligeringsassayet

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem affinitetsoprensning af proteinkomplekser fra eukaryote celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horisontal gelelektroforese til forbedret påvisning af protein-RNA-komplekser

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Påvisning af små GTPase Prenylation og GTP bindende ved hjælp af membran fraktionering og GTPase-forbundet Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: et-trins affinitet rensning for den parallelle analyse af Protein-Protein og Protein-metabolit komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Påvisning af Heterodimerization af Protein isoformer ved hjælp af en in Situ nærhed ligatur Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlæsning og DNA reparation analyse ved hjælp af Single Nucleotide udvidelse og MALDI-TOF-massespektrometri analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affinitet rensning af grønkorn Translocon Protein komplekser ved hjælp af tryk på Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Undersøgelse af metabolismen af seks systemiske insekticider i en nyetableret celle affjedrings kultur afledt af te (Camellia sinensis L.) Blade

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...