Name: detection and visualization of dna damage-induced protein complexes in suspension cell cultures using the proximity ligation assay
Uploaded: 2017-06-09T15:00:00
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Guikema研究所の研究は、オランダ科学研究機関（VIDIグラント016126355）およびStichting Kinderen Kankervrij KiKA（プロジェクト252）のInnovational Research Incentives Schemeによる資金提供を受けています。

1.細胞の処理とDNA損傷誘導<ol><li> 20％FCS、50μMβ-メルカプトエタノール、2mM L-グルタミン、100U / mLペニシリンおよび100μg/ mLストレプトマイシンを補充したIMDM中のヒトBCR-ABL + B細胞急性リンパ芽球性細胞系BV173またはSUP-B15を、 37℃、5％CO 2の雰囲気下で培養した。細胞を計数し、5mL /ウェルで6ウェルプレート中で2×10 6細胞/ mLでプレートする。 注：任意に、様々な起源の懸...

<ol>
	<li>Mar&#233;chal, A., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage+Sensing+by+the+ATM+and+ATR+Kinases.">DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716 (2013).</li><li>Huen, M. S. Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+checkpoint+and+repair+machineries+at+DNA+damage+sites.">Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites.</a> Trends Biochem Sci. 35 (2), 101-108 (2010).</li><li>Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+function+of+DNA+double-strand+break+repair+foci+in+mammalian+cells.">Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells.</a> DNA Repair. 9 (12), 1219-1228 (2010).</li><li>Matsuoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+and+ATR+substrate+analysis+reveals+extensive+protein+networks+responsive+to+DNA+damage.">ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage.</a> Science. 316 (5828), 1160-1166 (2007).</li><li>Barlow, C., Brown, K. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1-associated+exclusion+of+53BP1+from+DNA+damage+sites+underlies+temporal+control+of+DNA+repair.">BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 15), 3529-3534 (2012).</li><li>Gullberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sense+of+closeness:+protein+detection+by+proximity+ligation.">A sense of closeness: protein detection by proximity ligation.</a> Curr Opin Biotechnol. 14 (1), 82-86 (2003).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li><li>Dong, Y., Shannon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+immunosensing+using+antigen+and+antibody+monolayers+on+gold+surfaces+with+electrochemical+and+scanning+probe+detection.">Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surfaces with electrochemical and scanning probe detection.</a> Anal Chem. 72 (11), 2371-2376 (2000).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li><li>Economopoulou, P., Pappa, V., Papageorgiou, S., Dervenoulas, J., Economopoulos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormalities+of+DNA+repair+mechanisms+in+common+hematological+malignancies.">Abnormalities of DNA repair mechanisms in common hematological malignancies.</a> Leuk Lymphoma. 52 (4), 567-582 (2011).</li><li>Rendleman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+DNA+repair+pathways+and+risk+of+non-Hodgkin's+lymphoma.">Genetic variation in DNA repair pathways and risk of non-Hodgkin's lymphoma.</a> PloS One. 9 (7), e101685 (2014).</li><li>Ochodnicka-Mackovicova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+Damage+Response+Regulates+RAG1/2+Expression+in+Pre-B+Cells+through+ATM-FOXO1+Signaling.">The DNA Damage Response Regulates RAG1/2 Expression in Pre-B Cells through ATM-FOXO1 Signaling.</a> J Immunol. , (2016).</li><li>Banin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+phosphorylation+of+p53+by+ATM+in+response+to+DNA+damage.">Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage.</a> Science. 281 (5383), 1674-1677 (1998).</li></ol>

この報告では、PLAを用いて、懸濁細胞培養におけるタンパク質間の特異的相互作用を決定し可視化することができることが示されている。注目すべきは、ここに記載されたプロトコールは、DNA修復複合体の研究に限定されず、懸濁細胞培養における他のタンパク質 - タンパク質相互作用を視覚化および定量化するためにも適用される。 ATMキナーゼは、DNA損傷誘発剤に暴露された場合、G1-停止...

DNA損傷は、タンパク質 - タンパク質相互作用、およびDNAの効率的かつ迅速な修復を確実にする翻訳後修飾を含む高度に制御された一連の事象を誘発し、それによってゲノムの完全性1を保護する 。典型的には、DNA修復は、（共焦点）蛍光顕微鏡法によるいわゆる電離放射線誘導病巣（IRIF）の形成をモニターすることによって電離放射線に曝露された細胞において研究される。多くのDNA修復およびDNA損傷感知タンパク質はIRIFを形成し、これはDNA損傷を維持するクロマチン部位で核形成するタンパク質複合体を表す2,3 。時間の経過とともにIRIFの位置と解像度は、DNA修復の時空間的組織化に重要な洞察を与え、異なるDNA修復経路の関与を示している可能性がある。損傷が達成されたDNA損傷および細胞周期段階の性質は、どのDNA修復経路が活性化されるかを決定する。フォ<html> DNA複製（S期）に活発に関与する細胞では、相同組換え（HR）が優性のDNA修復経路であるのに対し、細胞周期のG1期またはG2 / M期の細胞では、相同末端結合（NHEJ）修復経路が優勢である。 DNA損傷後の最も初期の事象の1つは、細胞周期のG1-およびG2 / M-相において大部分が活性であり、NHEJを調節するDNA損傷感知キナーゼAtaxia毛細血管拡張突然変異タンパク質（ATM）の活性化であり、 HRを活性化することによってS期に作用するRad3関連タンパク質（ATR）を含むが、これらに限定されない。 ATMとATRの両方は、DNA修復、細胞死および生存に関与する多くのタンパク質をリン酸化する非常に多面的なキナーゼである4 。両方のキナーゼは、遺伝毒性ストレスに曝された後に腫瘍抑制タンパク質p53をリン酸化して活性化することが示されており、これらのキナーゼは、重要な腫瘍抑制シグナル伝達軸の上流メディエーターであることが示されている&quot;xref&quot;&gt; 5,6。 IRIFの形成および組成は、典型的には、2色免疫蛍光染色および顕微鏡法を用いて異なるタンパク質の共局在を決定することによって評価されるが、修復タンパク質複合体の一部であるタンパク質のすべてがIRIFを形成するわけではない。さらに、（共焦点）免疫蛍光顕微鏡法は、光の回折特性によって制限され、約200〜300nmの空間分解能がかなり低く、ほとんどの細胞内構造のサイズを超えており、本質的にタンパク質 - タンパク質相互作用分子レベル。このように、（共焦点）蛍光顕微鏡によって検出される免疫蛍光染色パターンの共局在化は、必ずしも直接的なタンパク質 - タンパク質相互作用を示すものではない。最近、3次元構造物のような新しい超解像技術が開発されている共焦点レーザー走査顕微鏡8で検出できなかったこれらのタンパク質の空間分布特性を明らかにする、ナノスケールの詳細における53BP1およびBRCA1 IRIF形成の研究に首尾よく使用された、テューティング照明顕微鏡（3D-SIM） 7 。 イン・ビボでのタンパク質 - タンパク質相互作用、例えば共免疫沈降法、プルダウン法および酵母ツーハイブリッドスクリーニング法を検出するために、いくつかの他の方法を使用することができる。しかしながら、これらの技術はかなり煩雑であり、多量の細胞またはタンパク質を必要とするか、またはタンパク質の過剰発現を伴い、実験的人工物を導入する。最近では、Proximity Ligation Assay（PLA） 9,10と呼ばれるin-situ （ すなわち 、細胞および組織における）タンパク質 - タンパク質相互作用の視覚化および定量化を可能にする新規な技術が開発されている。 Pr関心対象の2つのタンパク質を認識する二価抗体は、オリゴヌクレオチド（いわゆるPLAプローブ）にコンジュゲートされた二次抗体によって検出される。 2つの異なる二次抗体が、一次抗体によって認識されるタンパク質間の相互作用のために十分に接近している場合、結合オリゴヌクレオチドはハイブリダイズし、ライゲーションして閉環状DNA基質を形成することができる。この環状基質は続いてローリングサークル増幅により増幅され、蛍光色素と結合した相補的オリゴヌクレオチドで視覚化される。 PLAを使用すると、蛍光標識されたローリングサークル増幅産物がPLAプローブに付着したままであるので、タンパク質 - タンパク質相互作用の細胞内局在が保存される。このアッセイの分解能は、抗体の直径が約7〜10nmであるという知見に基づいて&lt;50nmである11 。ローリングサークル増幅は、2対の抗体（プライマリ+セコンdary）は、そのサイズ（10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm）で定義される周囲内で物理的に相互作用します。シグナル増幅工程は、PLAアッセイの感度を高め、ほとんど発現しないタンパク質の相互作用の検出を可能にする。 PLAは、細胞間単位で定量することができる点状の病巣様シグナルパターンを生成し、それによってタンパク質 - タンパク質相互作用における細胞内および細胞間の変動を評価することができる。 DNA修復複合体およびIRIFの形成および組成は、ヒト骨肉腫上皮細胞株U2OS、ヒト胎児腎細胞株HEK293および網膜色素上皮細胞株RPE-1のような接着細胞株で研究されており、増殖し、トランスフェクションしやすい。これらのリンパ系細胞系および骨髄系細胞系のような懸濁細胞培養は、トランスフェクションの影響を受けにくく、一般的にカバーガラスに付着しないため、使用頻度が低いイメージングのためのeps。しかし、DNA損傷応答は、これらの腫瘍におけるゲノム（ドライバー）異常によって頻繁に影響され、正常なリンパ系および骨髄系の悪性形質転換において中心的な役割を果たすため、リンパ系および骨髄系の悪性疾患の状況において、前駆細胞）細胞12,13,14 。 このプロトコールは、浮遊細胞培養におけるDNA損傷の誘導後にPLAがどのようにしてタンパク質 - タンパク質相互作用を評価および定量するために使用され得るかを記載する。ここで、PLAは、G1期の細胞周期停止を受けるように誘導されたヒトB細胞白血病細胞におけるDNA損傷に対するATMとp53との間の相互作用を決定し可視化するために行われる。注目すべきは、ここに提示されたプロトコルは、G1拘束性白血病細胞におけるATMおよびp53相互作用の研究に限定されないが、他のタンパク質 - タンパク質相互作用を視覚化するために使用することもできる種々の細胞型および懸濁細胞培養における細胞の増殖を阻害する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BV173 cell line</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>AC-20</td>
			<td>BCR-ABL+ B-ALL cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUP-B15 cell line</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC-389</td>
			<td>BCR-ABL+ B-ALL cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>21980-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>lot #: 064M3396</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imatinib methanesulfonate</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>I-5508</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neocarzinostatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N9162</td>
			<td>Mutagenic/teratogenic, handle with care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KU55933</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1092</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starfrost Microscopy Slides</td>
			<td>Waldemar Knittel</td>
			<td>VA11200 003FKB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen liquid blocker</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin funnel</td>
			<td>Q Path Labonord SAS</td>
			<td>003411324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DUO92105</td>
			<td>Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat-anti-ATM</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-136A</td>
			<td>PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit-anti-phospho-Ser15-p53</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9284</td>
			<td>We succesfully used lot #9284-4 in our studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield antifading mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield antifading mounting medium</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde in PBS</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-281692</td>
			<td>Also available from various other vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and visualization of dna damage-induced protein complexes in suspension cell cultures using the proximity ligation assay

DNA損傷応答は、自発的に起こる、遺伝毒性ストレスに起因する、またはリンパ球におけるプログラムされたDNA切断の状況で現れるDNA損傷の修復を調整する。 Ataxia-Telangiectasia突然変異キナーゼ（ATM）、ATMおよびRad3関連キナーゼ（ATR）およびDNA依存性プロテインキナーゼ（DNA-PKcs）の触媒サブユニットは、DNA損傷の誘導時に活性化される最初のものであり、 DNA修復、アポトーシスおよび細胞生存を制御するネットワークの中央調節因子である。腫瘍抑制経路の一部として、ATMおよびATRはリン酸化を介してp53を活性化し、それによってp53の転写活性を調節する。 DNA損傷はまた、DNA損傷センサの複合体を表す、いわゆる電離放射線誘導病巣（IRIF）の形成をもたらし、蛍光顕微鏡検査によって視覚化されるDNA損傷部位に蓄積する。しかし、IRIFにおけるタンパク質の共局在は、必ずしもd蛍光顕微鏡法の分解能が限られているため、直接的なタンパク質 - タンパク質相互作用が必要である。 その場での近接性ライゲーションアッセイ（PLA）は、前例のない特異性および感度を有する細胞および組織におけるタンパク質 - タンパク質相互作用の直接的な可視化を可能にする新規技術である。この技術は、目的のタンパク質に結合する特異的抗体の空間的近接性に基づいている。調べられたタンパク質が約40nm以内にある場合、増幅反応は、抗体にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドによって誘発され、増幅産物は、蛍光標識によって視覚化され、相互作用タンパク質の細胞下の位置に対応するシグナルを生じる。 ATMとp53との間の確立された機能的相互作用を例として、ここでは、DNA損傷応答の不可欠な部分であるタンパク質間の直接的相互作用を研究するために、浮遊細胞培養においてPLAがどのように使用され得るかが実証される。

残基Ser15におけるp53のリン酸化は、ATMキナーゼ活性に依存することが示された16 。懸濁細胞培養のサイトスピン調製物に対するPLA技術の特異性を実証し確認するために、細胞周期のG1期に停止したBCR-ABL + B-ALL細胞の2時間のNCS処理によるDNA損傷の誘導が示されている予想通り、ATMとホスホ-Ser15-p53との間の特異的相互作用を生じた。 NCSで処理した細胞の...

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Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

ここでは、 in situ Proximity Ligation Assay（PLA）を使用して、遺伝毒性ストレスに曝された懸濁細胞培養におけるATMとp53との間の直接タンパク質 - タンパク質相互作用の検出および可視化を実証する。

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

共免疫沈降により核および細胞質画分中のタンパク質間相互作用の可視化と<em&gt;その場で</em&gt;近接ライゲーションアッセイ

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

真核細胞からのタンパク質複合体のタンデムアフィニティー精製

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

タンパク質-RNA複合体の検出を向上させるための水平ゲル電気泳動

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

小さい gtp アーゼ プレニル化および分子量 GTP 結合を使用して膜分画と gtp アーゼ抗体法の検出

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 の 1: タンパク質・ タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

その場で近接結紮アッセイを用いたタンパク質アイソ フォームの Heterodimerization の検出

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

校正と単一のヌクレオチドの拡張子と MALDI-TOF 質量分析を用いた DNA 修復アッセイ

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

タップのタグを使用して葉緑体トランスロコン タンパク質複合体の親和性の浄化

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

蛍光顕微鏡を使用して競争力のある滴定による転写因子の DNA 結合親和性の高感度測定

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

茶由来の新たに確立された細胞懸濁液培養における6種の全身殺虫剤の代謝に関する研究(カメリアシネンシスL.葉

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...