Name: detection and visualization of dna damage-induced protein complexes in suspension cell cultures using the proximity ligation assay
Uploaded: 2017-06-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Forskning i Guikema laboratoriet er finansiert av Innovative Research Incentives Scheme fra Den nederlandske organisasjonen for vitenskapelig forskning (VIDI-stipend 016126355) og Stichting Kinderen Kankervrij KiKA (prosjekt 252).

1. Behandling av celler og DNA-skadeinduksjon <ol><li> Kultur de humane BCR-ABL + B-cellens akutte lymfoblastiske cellelinjer BV173 eller SUP-B15 i IMDM suppleret med 20% FCS, 50 μM p-merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin ved 37 ° C i en atmosfære av 5% C02. Telle celler og plate ved 2 x 106 celler / ml i 6 brønner plater, ved 5 ml / brønn. MERK: Suspensjonscellelinjer av forskjellig opprinnelse kan eventuelt brukes. </li><li> For å arrestere...

<ol>
	<li>Mar&#233;chal, A., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage+Sensing+by+the+ATM+and+ATR+Kinases.">DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716 (2013).</li><li>Huen, M. S. Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+checkpoint+and+repair+machineries+at+DNA+damage+sites.">Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites.</a> Trends Biochem Sci. 35 (2), 101-108 (2010).</li><li>Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+function+of+DNA+double-strand+break+repair+foci+in+mammalian+cells.">Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells.</a> DNA Repair. 9 (12), 1219-1228 (2010).</li><li>Matsuoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+and+ATR+substrate+analysis+reveals+extensive+protein+networks+responsive+to+DNA+damage.">ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage.</a> Science. 316 (5828), 1160-1166 (2007).</li><li>Barlow, C., Brown, K. D., Deng, C. X., Tagle, D. A., Wynshaw-Boris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atm+selectively+regulates+distinct+p53-dependent+cell-cycle+checkpoint+and+apoptotic+pathways.">Atm selectively regulates distinct p53-dependent cell-cycle checkpoint and apoptotic pathways.</a> Nature Genet. 17 (4), 453-456 (1997).</li><li>Tibbetts, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+ATR+in+the+DNA+damage-induced+phosphorylation+of+p53.">A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53.</a> Genes Dev. 13 (2), 152-157 (1999).</li><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+Multicolor+Imaging+of+the+Nuclear+Periphery+with+3D+Structured+Illumination+Microscopy.">Subdiffraction Multicolor Imaging of the Nuclear Periphery with 3D Structured Illumination Microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li><li>Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1-associated+exclusion+of+53BP1+from+DNA+damage+sites+underlies+temporal+control+of+DNA+repair.">BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 15), 3529-3534 (2012).</li><li>Gullberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sense+of+closeness:+protein+detection+by+proximity+ligation.">A sense of closeness: protein detection by proximity ligation.</a> Curr Opin Biotechnol. 14 (1), 82-86 (2003).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li><li>Dong, Y., Shannon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+immunosensing+using+antigen+and+antibody+monolayers+on+gold+surfaces+with+electrochemical+and+scanning+probe+detection.">Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surfaces with electrochemical and scanning probe detection.</a> Anal Chem. 72 (11), 2371-2376 (2000).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li><li>Economopoulou, P., Pappa, V., Papageorgiou, S., Dervenoulas, J., Economopoulos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormalities+of+DNA+repair+mechanisms+in+common+hematological+malignancies.">Abnormalities of DNA repair mechanisms in common hematological malignancies.</a> Leuk Lymphoma. 52 (4), 567-582 (2011).</li><li>Rendleman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+DNA+repair+pathways+and+risk+of+non-Hodgkin's+lymphoma.">Genetic variation in DNA repair pathways and risk of non-Hodgkin's lymphoma.</a> PloS One. 9 (7), e101685 (2014).</li><li>Ochodnicka-Mackovicova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+Damage+Response+Regulates+RAG1/2+Expression+in+Pre-B+Cells+through+ATM-FOXO1+Signaling.">The DNA Damage Response Regulates RAG1/2 Expression in Pre-B Cells through ATM-FOXO1 Signaling.</a> J Immunol. , (2016).</li><li>Banin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+phosphorylation+of+p53+by+ATM+in+response+to+DNA+damage.">Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage.</a> Science. 281 (5383), 1674-1677 (1998).</li></ol>

I denne rapporten er det påvist at PLA kan brukes til å bestemme og visualisere den spesifikke samspillet mellom proteiner i suspensjonscellekulturer. Av protokollen er protokollen beskrevet her ikke begrenset til studiet av DNA-reparasjonskomplekser, men gjelder også for å visualisere og kvantifisere andre protein-protein-interaksjoner i suspensjonscellekulturer. Det er vist at ATM-kinasen interagerer med fosforylert p53 i G1-arresterte BCR-ABL + B-ALL-celler når de eksponeres for et DNA-skadefremkallende middel. ...

DNA-skader utløser en svært regulert serie hendelser som involverer protein-protein-interaksjoner og post-translasjonelle modifikasjoner som sikrer effektiv og rask reparasjon av DNA, og derved opprettholder genomisk integritet 1 . Typisk blir DNA-reparasjon studert i celler utsatt for ioniserende stråling ved å overvåke dannelsen av såkalt ioniserende strålingsinducert foci (IRIF) ved (konfokal) fluorescensmikroskopi. Mange DNA-reparasjon og DNA-skade-sensing-proteiner danner IRIF, som representerer proteinkomplekser som nukleerer ved kromatinsteder som opprettholder DNA-skade 2 , 3 . Plasseringen og oppløsningen av IRIFs over tid gir viktig innsikt i spatiotemporal organisering av DNA-reparasjon, og kan indikere involvering av forskjellige DNA-reparasjonsveier. Naturen til DNA-skaden og cellesyklus-scenen hvor skadene oppnås bestemmer hvilken DNA-reparasjonsvei som aktiveres. fo<html> For eksempel, i celler som er aktivt engasjert i DNA-replikasjon (S-fase), er homolog rekombination (HR) den dominerende DNA-reparasjonsveien, mens i celler i G1- eller G2 / M-fasen av cellesyklusen, Homologe end-joining (NHEJ) reparasjonsveien dominerer. En av de tidligste hendelsene som følge av DNA-skade er aktiveringen av DNA-skade-sensing kinaser Ataxia Telangiectasia-Mutated Protein (ATM), som hovedsakelig er aktiv i G1- og G2 / M-faser av cellesyklusen og regulerer NHEJ, Og Ataxia Telangiectasia og Rad3-relatert protein (ATR), som virker i S-fase ved å aktivere HR. Både ATM og ATR er svært pleiotropiske kinaser som fosforylerer mange proteiner som er involvert i DNA-reparasjon, celledød og overlevelse 4 . Begge kinaser har vist seg å fosforylere og aktivere tumor-suppressorproteinet p53 etter eksponeringen for genotoksisk stress, noe som indikerer at disse kinaser er oppstrøms mediatorer av en svingende svulstundertrykkende akse&quot;Xref&quot;&gt; 5 , 6 . Dannelsen og sammensetningen av IRIFs blir typisk vurdert ved å bestemme co-lokalisering av forskjellige proteiner ved bruk av tofarget immunfluorescensfarging og mikroskopi, men ikke alle proteiner som inngår i reparasjonsproteinkomplekser danner IRIF, som begrenser anvendeligheten av denne tilnærmingen. Videre er (konfokal) immunfluorescensmikroskopi begrenset av diffraksjonsegenskapene til lys, noe som resulterer i en ganske dårlig romlig oppløsning på ca. 200-300 nm, som overskrider størrelsen på de fleste subcellulære strukturer, som i det vesentlige forbyr direkte forhør av protein-protein-interaksjoner ved Molekylært nivå. Som sådan er co-lokalisering av immunfluorescensfargemønstre som detekteres av (konfokal) fluorescensmikroskopi ikke nødvendigvis indikativ for direkte protein-protein-interaksjoner. Nylig ble det utviklet nye superoppløsnings teknologier, for eksempel tredimensjonale strucTured illuminasjonsmikroskopi (3D-SIM) 7 , som ble vellykket brukt til å studere 53BP1- og BRCA1-IRIF-dannelse ved nanoskala detaljer, avslørende de romlige fordelingsegenskapene til disse proteinene som ikke kunne detekteres ved hjelp av konfokal laserskanningsmikroskopi 8 . Flere andre metoder kan brukes til å oppdage protein-protein-interaksjoner in vivo , slik som co-immunutfelling, nedtrekksmetoder og gjær-to-hybrid screening tilnærminger. Imidlertid er disse teknikkene ganske besværlige, krever store mengder celler eller proteiner eller involverer overekspresjon av proteiner, som introduserer eksperimentelle artefakter. Mer nylig er det utviklet en ny teknikk som muliggjør visualisering og kvantifisering av protein-protein-interaksjoner in situ ( dvs. i celler og i vev), som kalles Proximity Ligation Assay (PLA) 9 , 10 . PrImary-antistoffer som gjenkjenner to proteiner av interesse, oppdages av sekundære antistoffer som er konjugert til oligonukleotider (såkalte PLA-prober). Hvis de to forskjellige sekundære antistoffene er tilstrekkelig tette på grunn av interaksjoner mellom proteiner som er anerkjent av de primære antistoffene, hybridiserer de konjugerte oligonukleotider og kan ligeres for å danne et lukket, sirkulært DNA-substrat. Dette sirkulære substratet amplifiseres deretter ved hjelp av rullesirkelforsterkning og visualiseres med fluorokrom-konjugerte komplementære oligonukleotider. Ved bruk av PLA, blir den subcellulære lokalisering av protein-protein-interaksjonen bevaret da det fluorescensmerkede merkesirkulasjonsforsterkningsprodukt forblir festet til PLA-prober. Oppløsningen av denne analysen er &lt;50 nm, basert på funnet at diameteren av et antistoff er ca. 7-10 nm 11 . Ringsirkulasjonsforsterkning kan bare skje dersom to par antistoffer (primær + sekonDary) fysisk samhandle innenfor perimeter som er definert av deres størrelse (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). Signalforsterkningstrinnet øker sensitiviteten til PLA-analysen og muliggjør gjenkjenning av vekselvirkninger av knapt uttrykte proteiner. PLA genererer punkterte, foci-lignende signaler som kan kvantifiseres per per-cellebasis, hvorved intra- og intercellulær variasjon i protein-protein-interaksjoner kan vurderes. Dannelsen og sammensetningen av DNA-reparasjonskomplekser og IRIF-er blir for det meste studert i adherente cellelinjer, slik som epitelcellelinjen U2OS, den humane embryonale nyrelinje HEK293 og den retinale pigmentepitelcellelinjen RPE-1, som er hurtig- Voksende og lett å transfektere. Suspensjoncellekulturer slike lymfoide og myeloidcellelinjer benyttes sjeldnere, da disse er mindre mottagelige for transfeksjon og generelt ikke holder seg til dekselglass, og krever dermed tillegg / alternativ stEps for bildebehandling. Oppløsningen av DNA-skade er imidlertid svært relevant i sammenheng med lymfoide og myeloid maligniteter, da DNA-skaderesponsen ofte blir påvirket av genomiske (driver) avvik i disse svulstene, og spiller en sentral rolle i den ondartede transformasjonen av normal lymfoid og myeloid ( Progenitor) celler 12 , 13 , 14 . Denne protokollen beskriver hvordan PLA kan brukes til å vurdere og kvantifisere protein-protein-interaksjoner etter induksjon av DNA-skade i suspensjonscellekulturer. Her blir PLA utført for å bestemme og visualisere interaksjonene mellom ATM og p53 ved DNA-skade i humane B-celle leukemiceller som er indusert til å gjennomgå en G1-fase celle-syklusarrest. Av notatet er protokollen som presenteres her ikke begrenset til å studere ATM- og p53-interaksjoner i G1-arresterte leukemiceller, men kan også brukes til å visualisere andre protein-protein-interaksjonerI forskjellige celletyper og suspensjoncellekulturer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BV173 cell line</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>AC-20</td>
			<td>BCR-ABL+ B-ALL cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUP-B15 cell line</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC-389</td>
			<td>BCR-ABL+ B-ALL cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>21980-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>lot #: 064M3396</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imatinib methanesulfonate</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>I-5508</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neocarzinostatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N9162</td>
			<td>Mutagenic/teratogenic, handle with care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KU55933</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1092</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starfrost Microscopy Slides</td>
			<td>Waldemar Knittel</td>
			<td>VA11200 003FKB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen liquid blocker</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin funnel</td>
			<td>Q Path Labonord SAS</td>
			<td>003411324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DUO92105</td>
			<td>Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat-anti-ATM</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-136A</td>
			<td>PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit-anti-phospho-Ser15-p53</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9284</td>
			<td>We succesfully used lot #9284-4 in our studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield antifading mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield antifading mounting medium</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde in PBS</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-281692</td>
			<td>Also available from various other vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and visualization of dna damage-induced protein complexes in suspension cell cultures using the proximity ligation assay

DNA skade respons respekterer reparasjon av DNA lesjoner som oppstår spontant, er forårsaket av genotoksisk stress, eller vises i sammenheng med programmerte DNA pauser i lymfocytter. Ataxia-Telangiectasia Mutated Kinase (ATM), ATM- og Rad3-relatert kinase (ATR) og den katalytiske underenheten av DNA-avhengig proteinkinase (DNA-PKcs) er blant de første som aktiveres ved induksjon av DNA-skade og er Sentrale regulatorer av et nettverk som styrer DNA-reparasjon, apoptose og celleoverlevelse. Som en del av en tumor-undertrykkende vei aktiverer ATM og ATR p53 gjennom fosforylering, og regulerer dermed transkriptjonsaktiviteten til p53. DNA-skade resulterer også i dannelsen av såkalt ioniserende strålingsinducert foci (IRIF) som representerer komplekser av DNA-skadesensor og reparasjonsproteiner som akkumuleres ved DNA-skader, som er visualisert ved fluorescensmikroskopi. Samlokalisering av proteiner i IRIF betyr imidlertid ikke nødvendigvis dEkstreme protein-protein-interaksjoner, da oppløsningen av fluorescensmikroskopi er begrenset. In situ Proximity Ligation Assay (PLA) er en ny teknikk som muliggjør direkte visualisering av protein-protein-interaksjoner i celler og vev med uovertruffen spesifisitet og følsomhet. Denne teknikken er basert på den romlige nærheten til spesifikke antistoffer som binder til proteiner av interesse. Når de forhørte proteinene er innenfor ~ 40 nm, utløses en amplifikasjonsreaksjon av oligonukleotider som er konjugert til antistoffene, og amplifikasjonsproduktet visualiseres ved fluorescensmerking, hvilket gir et signal som tilsvarer den intercellulære plasseringen av de samvirkende proteiner. Ved å bruke den etablerte funksjonelle samspillet mellom ATM og p53 som et eksempel, er det demonstrert her hvor PLA kan brukes i suspensjonscellekulturer for å studere de direkte vekselvirkninger mellom proteiner som er integrerte deler av DNA-skaderesponsen.

Fosforylering av p53 ved rest Ser15 ble vist å være avhengig av ATM-kinaseaktivitet 16 . For å demonstrere og bekrefte spesifisiteten til PLA-teknikken på cytospinpreparater av suspensjoncellekulturer, er det vist at induksjon av DNA-skade ved 2 timers NCS-behandling av BCR-ABL + B-ALL-celler arrestert i G1-fasen av cellesyklusen Resulterte i den spesifikke interaksjonen mellom ATM og fosfor-Ser15-p53, som forventet. Punkterte PLA-signaler ble observert i kjer...

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Her er det demonstrert hvordan in situ Proximity Ligation Assay (PLA) kan brukes til å oppdage og visualisere direkte protein-protein-interaksjonene mellom ATM og p53 i suspensjoncellekulturer utsatt for genotoksisk stress.

Deteksjon og visualisering av DNA-skadeinducerte proteinkomplekser i suspensjoncellekulturer ved bruk av næringslysanalysen

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualisering av Protein-protein Interaksjon i Kjerne- og cytoplasmatiske Fraksjoner av Co-immunoprecipitation og<em&gt; In Situ</em&gt; Nærhet hemorroider Assay

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity Rensing av protein komplekser fra eukaryote celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horisontal gelelektroforese for forbedret deteksjon av protein-RNA-komplekser

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Påvisning av små GTPase Prenylation og GTP bindende ved hjelp av membran fraksjoneres og GTPase-koblede Immunosorbent analysen

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: trinns affinitet rensing for parallell analyse av Protein-Protein og Protein-metabolitten komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Deteksjon av Heterodimerization av Protein isoformene bruker in Situ nærhet Ligation analysen

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlesing og DNA reparasjon analysen Single nukleotid forlengelse og MALDI-TOF massespektrometri analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affinitet rensing av Chloroplast Translocon Protein komplekser hjelp av trykk-koden

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høy følsomhet måling av transkripsjon faktor-DNA Binding slektskap av konkurransedyktige titrering bruker fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studier på metabolismen av seks systemiske insektmidler i en nylig etablert Cell suspensjon kultur avledet fra Tea (Camellia Sinensis L.) Blader

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...