Name: detection and visualization of dna damage-induced protein complexes in suspension cell cultures using the proximity ligation assay
Uploaded: 2017-06-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay at JoVE.com

A pesquisa no laboratório Guikema é financiada pelo Programa de Incentivos à Pesquisa Innovacional da Organização para Pesquisa Científica dos Países Baixos (concessão VIDI 016126355) e o KiKA &quot;Stichting Kinderen Kankervrij&quot; (projeto 252).

1. Tratamento de indução de células e dano de DNA <ol><li> Cultive as linhas celulares linfoblásticas agudas BCR-ABL + B celulares BV173 ou SUP-B15 em IMDM suplementado com FCS a 20%, β-mercaptoetanol 50 μM, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U / mL e estreptomicina 100 μg / mL em 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 . Conte células e placa a 2 x 10 6 células / mL em placas de 6 poços, a 5 mL / poço. NOTA: Opcionalmente, as linhas celulares de suspensão de várias origens podem s...

<ol>
	<li>Mar&#233;chal, A., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage+Sensing+by+the+ATM+and+ATR+Kinases.">DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716 (2013).</li><li>Huen, M. S. Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+checkpoint+and+repair+machineries+at+DNA+damage+sites.">Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites.</a> Trends Biochem Sci. 35 (2), 101-108 (2010).</li><li>Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+function+of+DNA+double-strand+break+repair+foci+in+mammalian+cells.">Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells.</a> DNA Repair. 9 (12), 1219-1228 (2010).</li><li>Matsuoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+and+ATR+substrate+analysis+reveals+extensive+protein+networks+responsive+to+DNA+damage.">ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage.</a> Science. 316 (5828), 1160-1166 (2007).</li><li>Barlow, C., Brown, K. D., Deng, C. X., Tagle, D. A., Wynshaw-Boris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atm+selectively+regulates+distinct+p53-dependent+cell-cycle+checkpoint+and+apoptotic+pathways.">Atm selectively regulates distinct p53-dependent cell-cycle checkpoint and apoptotic pathways.</a> Nature Genet. 17 (4), 453-456 (1997).</li><li>Tibbetts, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+ATR+in+the+DNA+damage-induced+phosphorylation+of+p53.">A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53.</a> Genes Dev. 13 (2), 152-157 (1999).</li><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+Multicolor+Imaging+of+the+Nuclear+Periphery+with+3D+Structured+Illumination+Microscopy.">Subdiffraction Multicolor Imaging of the Nuclear Periphery with 3D Structured Illumination Microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li><li>Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1-associated+exclusion+of+53BP1+from+DNA+damage+sites+underlies+temporal+control+of+DNA+repair.">BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 15), 3529-3534 (2012).</li><li>Gullberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sense+of+closeness:+protein+detection+by+proximity+ligation.">A sense of closeness: protein detection by proximity ligation.</a> Curr Opin Biotechnol. 14 (1), 82-86 (2003).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li><li>Dong, Y., Shannon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+immunosensing+using+antigen+and+antibody+monolayers+on+gold+surfaces+with+electrochemical+and+scanning+probe+detection.">Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surfaces with electrochemical and scanning probe detection.</a> Anal Chem. 72 (11), 2371-2376 (2000).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li><li>Economopoulou, P., Pappa, V., Papageorgiou, S., Dervenoulas, J., Economopoulos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormalities+of+DNA+repair+mechanisms+in+common+hematological+malignancies.">Abnormalities of DNA repair mechanisms in common hematological malignancies.</a> Leuk Lymphoma. 52 (4), 567-582 (2011).</li><li>Rendleman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+DNA+repair+pathways+and+risk+of+non-Hodgkin's+lymphoma.">Genetic variation in DNA repair pathways and risk of non-Hodgkin's lymphoma.</a> PloS One. 9 (7), e101685 (2014).</li><li>Ochodnicka-Mackovicova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+Damage+Response+Regulates+RAG1/2+Expression+in+Pre-B+Cells+through+ATM-FOXO1+Signaling.">The DNA Damage Response Regulates RAG1/2 Expression in Pre-B Cells through ATM-FOXO1 Signaling.</a> J Immunol. , (2016).</li><li>Banin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+phosphorylation+of+p53+by+ATM+in+response+to+DNA+damage.">Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage.</a> Science. 281 (5383), 1674-1677 (1998).</li></ol>

Neste relatório, é demonstrado que PLA pode ser usado para determinar e visualizar a interação específica entre proteínas em culturas de células em suspensão. De notar que o protocolo aqui descrito não se restringe ao estudo de complexos de reparo de DNA, mas também se aplica para visualizar e quantificar outras interações proteína-proteína em culturas de células em suspensão. Mostra-se que a quinasa ATM interage com p53 fosforilada em células BCR-ABL + B-ALL presas em G1 quando expostas a um agente ind...

O dano do DNA desencadeia uma série altamente regulada de eventos envolvendo interações proteína-proteína e modificações pós-tradução que garantem o reparo eficiente e rápido do DNA, salvaguardando assim a integridade genômica 1 . Tipicamente, o reparo do DNA é estudado em células expostas à radiação ionizante, monitorando a formação dos chamados focos induzidos por radiação ionizante (IRIF) por microscopia de fluorescência (confocal). Muitas proteínas de detecção e detecção de dano do DNA formam IRIFs, que representam complexos de proteínas que nucleam em locais de cromatina sustentando dano de DNA 2 , 3 . A localização e a resolução dos IRIF ao longo do tempo fornecem uma visão importante da organização espaciotemporal do reparo do DNA e podem indicar o envolvimento de diferentes caminhos de reparo do DNA. A natureza do dano do DNA eo estágio do ciclo celular em que o dano é atingido determinam qual caminho de reparo do DNA é ativado. Fo<html> Por exemplo, em células ativamente envolvidas na replicação de DNA (fase S), a recombinação homóloga (HR) é a via de reparo do DNA dominante, enquanto que nas células na fase G1 ou G2 / M do ciclo celular, a célula não- É predominante a via de reparo homóloga de junção final (NHEJ). Um dos primeiros eventos após o dano do DNA é a ativação das cinases sensíveis ao dano do DNA Ataxia Telangiectasia-proteína mutada (ATM), que é principalmente ativa nas fases G1 e G2 / M do ciclo celular e regula o NHEJ, E Ataxia Telangiectasia e Proteína Relacionada a Rad3 (ATR), que atua em fase S ativando a FC. Ambos ATM e ATR são quinases muito pleiotrópicas que fosforilam muitas proteínas envolvidas no reparo do DNA, morte celular e sobrevida 4 . Ambas as quinases demonstraram fosforilar e ativar a proteína supressora de tumores p53 após a exposição ao estresse genotóxico, indicando que essas cinases são mediadores a montante de um eixo de sinalização de supressão de tumor fundamental&quot;Xref&quot;&gt; 5 , 6 . A formação e a composição dos IRIFs são tipicamente avaliadas pela determinação da co-localização de diferentes proteínas usando coloração e microscopia de imunofluorescência de duas cores, no entanto, nem todas as proteínas que fazem parte dos complexos de proteínas de reparo formam IRIFs, o que limita a aplicabilidade desta abordagem. Além disso, a microscopia de imunofluorescência (confocal) é limitada pelas propriedades de difracção da luz, resultando em uma resolução espacial bastante fraca de cerca de 200-300 nm, excedendo o tamanho da maioria das estruturas subcelulares, o que essencialmente proíbe a interrogação direta das interações proteína-proteína ao O nível molecular. Como tal, a co-localização de padrões de coloração de imunofluorescência como detectada por microscopia de fluorescência (confocal) não é necessariamente indicativa de interações diretas proteína-proteína. Recentemente, novas tecnologias de super-resolução foram desenvolvidas, como a estrutura tridimensionalMicroscopia de iluminação tingida (3D-SIM) 7 , que foi utilizada com sucesso para estudar a formação de IRF de 53BP1 e BRCA1 em detalhes de nano-escala, revelando as características de distribuição espacial dessas proteínas que não foram detectadas por microscopia confocal de varredura a laser 8 . Vários outros métodos podem ser usados ​​para detectar interações proteína-proteína in vivo , tais como métodos de co-imunoprecipitação, pull-down e abordagens de rastreio de dois híbridos de fermento. No entanto, essas técnicas são bastante pesadas, exigem grandes quantidades de células ou proteínas ou envolvem a superexpressão de proteínas, que introduzem artefatos experimentais. Mais recentemente, desenvolveu-se uma nova técnica que permite a visualização e quantificação de interações proteína-proteína in situ ( isto é, nas células e nos tecidos), denominada Ensaio de Ligação Proxima (PLA) 9 , 10 . PrOs anticorpos imateriais que reconhecem duas proteínas de interesse são detectados por anticorpos secundários que são conjugados com oligonucleótidos (as chamadas sondas PLA). Se os dois anticorpos secundários diferentes forem suficientemente próximos devido às interacções entre as proteínas reconhecidas pelos anticorpos primários, os oligonucleótidos conjugados hibridam e podem ser ligados para formar um substrato de ADN circular fechado. Este substrato circular é subsequentemente amplificado por amplificação do círculo circulante e visualizado com oligonucleótidos complementares conjugados com fluorochrome. Usando PLA, a localização subcelular da interação proteína-proteína é preservada à medida que o produto de amplificação do círculo de rolamento com marcação fluorescente permanece ligado às sondas PLA. A resolução deste ensaio é &lt;50 nm, com base no achado de que o diâmetro de um anticorpo é de aproximadamente 7-10 nm 11 . A amplificação do círculo circulante só pode ocorrer no caso de dois pares de anticorpos (primário + segundo planoDary) interagem fisicamente dentro do perímetro que é definido pelo seu tamanho (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). O passo de amplificação do sinal aumenta a sensibilidade do ensaio de PLA e permite a detecção de interações de proteínas raramente expressas. O PLA gera padrões de sinais pontuais e focos que podem ser quantificados por célula, pelo qual a variação intra e intercelular nas interações proteína-proteína pode ser avaliada. A formação e composição de complexos de reparo de DNA e IRIFs são principalmente estudadas em linhas celulares aderentes, como a linha celular epitelial de osteossarcoma de osso humano U2OS, a linha de células de rim embrionárias humanas HEK293 e a linha de células epiteliais de pigmento retiniano RPE-1, Crescente e fácil de transfectar. As culturas de células de suspensão, tais como linhagens linfóides e mieloides, são usadas com menos frequência, uma vez que estas são menos favoráveis ​​à transfecção e, em geral, não aderem aos lamínulas, exigindo, assim, uma alternativa adicionalEps para imagens. A resolução do dano do DNA é, no entanto, muito relevante no contexto de malignidades linfóides e mielóides, uma vez que a resposta ao dano do DNA é freqüentemente afetada por aberrações genômicas (excitadores) nesses tumores, desempenhando um papel fundamental na transformação maligna de linfóides e mieloides normais ( Células progenitoras 12 , 13 , 14 . Este protocolo descreve como o PLA pode ser usado para avaliar e quantificar as interações proteína-proteína após a indução do dano do DNA em culturas de células em suspensão. Aqui, o PLA é realizado para determinar e visualizar as interações entre ATM e p53 após o dano do DNA em células de leucemia de células B humanas que são induzidas a sofrer uma parada do ciclo celular em fase G1. De notar que o protocolo aqui apresentado não se restringe ao estudo de interações ATM e p53 em células de leucemia detidas por G1, mas também pode ser usado para visualizar outras proteínas-proteína interativaEm vários tipos de células e culturas de células suspensas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BV173 cell line</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>AC-20</td>
			<td>BCR-ABL+ B-ALL cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUP-B15 cell line</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC-389</td>
			<td>BCR-ABL+ B-ALL cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>21980-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>lot #: 064M3396</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imatinib methanesulfonate</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>I-5508</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neocarzinostatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N9162</td>
			<td>Mutagenic/teratogenic, handle with care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KU55933</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1092</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starfrost Microscopy Slides</td>
			<td>Waldemar Knittel</td>
			<td>VA11200 003FKB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen liquid blocker</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin funnel</td>
			<td>Q Path Labonord SAS</td>
			<td>003411324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DUO92105</td>
			<td>Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat-anti-ATM</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-136A</td>
			<td>PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit-anti-phospho-Ser15-p53</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9284</td>
			<td>We succesfully used lot #9284-4 in our studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield antifading mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield antifading mounting medium</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde in PBS</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-281692</td>
			<td>Also available from various other vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and visualization of dna damage-induced protein complexes in suspension cell cultures using the proximity ligation assay

A resposta ao dano do DNA orquestrou o reparo de lesões de DNA que ocorrem espontaneamente, são causadas por estresse genotóxico ou aparecem no contexto de quebras de DNA programadas em linfócitos. A Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM e Rad3-kinase (ATR) e a subunidade catalítica de DNA-dependente Protein Kinase (DNA-PKcs) estão entre os primeiros que são ativados após a indução do dano do DNA, e são Reguladores centrais de uma rede que controla o reparo do DNA, a apoptose e a sobrevivência celular. Como parte de uma via supressora de tumor, ATM e ATR ativam p53 através da fosforilação, regulando assim a atividade transcricional de p53. O dano do DNA também resulta na formação dos chamados focos induzidos por radiação ionizante (IRIF) que representam complexos de sensor de dano de DNA e proteínas de reparo que se acumulam nos locais de dano do DNA, que são visualizados por microscopia de fluorescência. A co-localização de proteínas em IRIFs, no entanto, não implica necessariamente dInterações proteína-proteína diretas, uma vez que a resolução da microscopia de fluorescência é limitada. In-situ Proximity Ligation Assay (PLA) é uma técnica inovadora que permite a visualização direta de interações proteína-proteína em células e tecidos com especificidade e sensibilidade sem precedentes. Esta técnica é baseada na proximidade espacial de anticorpos específicos que se ligam às proteínas de interesse. Quando as proteínas interrogadas estão dentro de ~ 40 nm, uma reacção de amplificação é desencadeada por oligonucleótidos que são conjugados com os anticorpos e o produto de amplificação é visualizado por marcação fluorescente, produzindo um sinal que corresponde à localização subcelular das proteínas que interagem. Usando a interação funcional estabelecida entre ATM e p53 como exemplo, é demonstrado aqui como o PLA pode ser usado em culturas de células suspensas para estudar as interações diretas entre proteínas que são partes integrantes da resposta de danos ao DNA.

A fosforilação de p53 no resíduo Ser15 mostrou-se dependente da actividade de quinase ATM 16 . Para demonstrar e confirmar a especificidade da técnica de PLA em preparações de citospina de culturas de células em suspensão, mostra-se que a indução de dano do DNA por 2 h de tratamento NCS de células BCR-ABL + B-ALL presas na fase G1 do ciclo celular Resultou na interação específica entre ATM e phospho-Ser15-p53, como esperado. Os sinais PLA punctivos f...

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Aqui, é demonstrado como o Ensaio de Ligação à Proximidade in situ (PLA) pode ser usado para detectar e visualizar as interações proteínas-proteínas diretas entre ATM e p53 em culturas de células suspensas expostas ao estresse genotóxico.

Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualização de interação proteína-proteína em Citoplasmáticas frações nucleares e por co-imunoprecipitação e<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidade Ligadura Assay

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Bioquímica

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Eletroforese em gel horizontal para detecção melhorada de complexos de ARN-proteína

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Deteção de pequena GTPase Prenilação e GTP ligação usando o fracionamento de membrana e ensaio de imunoabsorção ligada de GTPase

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 em 1: uma etapa de purificação da afinidade para a análise paralela de proteína-proteína e proteína-metabólito complexos

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Deteção de Heterodimerization de isoformas de proteínas usando um ensaio de ligadura de proximidade em Situ

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Revisão e ensaio de reparo de DNA usando extensão de nucleotídeo único e análise de espectrometria de massa MALDI-TOF

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Purificação da afinidade do cloroplasto Translocon proteínas complexos usando a marca de torneira

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Medição de alta sensibilidade de afinidades de ligação do fator-DNA transcrição por titulação do competidor usando microscopia de fluorescência

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Estudo sobre o metabolismo de seis inseticidas sistêmicas em uma cultura de suspensão celular recém-estabelecida derivada do chá (Camellia sinensis L.) Folhas

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...