Name: oligopeptide competition assay for phosphorylation site determination
Uploaded: 2017-05-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Research Foundation of Korea tilskud finansieret af den koreanske regering (MSIP) (nr. 2015R1A2A1A10052663 og nr. 2014M1A3A3A02034698).

1. Sikkerhed FORSIGTIG: Denne protokol bruger [γ- 32 P] -ATP til at vurdere aktiviteten af ​​AMPK. Fosfor-32 er en radioaktiv isotop, der i høj grad udsender beta-stråling. Da størrelsen af ​​en beta-partikel er ekstremt lille, kan den let trænge ind i tøj og hud. Både ekstern og intern eksponering for beta-stråling kan være skadelig for menneskers sundhed, herunder ved at forårsage hudforbrændinger og vævsskader. <ol><li> Udfør alle trin, der kræver brug a...

<ol>
	<li>Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK:+An+energy-sensing+pathway+with+multiple+inputs+and+outputs.">AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs.</a> Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).</li><li>Gwinn, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+phosphorylation+of+raptor+mediates+a+metabolic+checkpoint.">AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint.</a> Mol Cell. 30, 214-226 (2008).</li><li>Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Nrf2+at+Ser-40+by+protein+kinase+C+regulates+antioxidant+response+element-mediated+transcription.">Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription.</a> J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).</li><li>Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant-induced+modification+of+INrf2+cysteine+151+and+PKC-delta-mediated+phosphorylation+of+Nrf2+serine+40+are+both+required+for+stabilization+and+nuclear+translocation+of+Nrf2+and+increased+drug+resistance.">Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance.</a> J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).</li><li>Jain, A. K., Jaiswal, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK-3beta+acts+upstream+of+Fyn+kinase+in+regulation+of+nuclear+export+and+degradation+of+NF-E2+related+factor+2.">GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2.</a> J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).</li><li>Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry:+myths,+facts,+and+the+consequences+for+qualitative+and+quantitative+measurements.">Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements.</a> Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).</li><li>Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+analysis+of+phosphorylation+sites:+a+quick+guide+for+cell+biologists.">Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists.</a> Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).</li><li>Joo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+facilitates+nuclear+accumulation+of+Nrf2+by+phosphorylating+at+Serine+550.">AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550.</a> Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).</li><li>Sinclair, W. K., Holloway, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half-lives+of+some+radioactive+isotopes.">Half-lives of some radioactive isotopes.</a> Nature. 167 (4244), 365 (1951).</li><li>Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Src+and+RACK1+is+enhanced+by+activation+of+protein+kinase+C+and+tyrosine+phosphorylation+of+RACK1.">The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1.</a> J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).</li><li>Smith, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RACK1+interacts+with+filamin-A+to+regulate+plasma+membrane+levels+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).</li></ol>

Som en enkel og bekvem måde til at vurdere ægtheden af ​​de forudsagte phosphoryleringssteder medieret af AMPK beskriver vi her et in vitro kinase assay, der kan anvendes til at opdage et specifikt phosphoryleringssted ved anvendelse af konkurrencedygtige peptider og for at verificere det ved anvendelse af en site-specifik mutant . De repræsentative data opnået fra det in vitro- konkurrencedygtige AMPK-aktivitetsassay matchede resultaterne fra et assay ved anvendelse af et site-rettet mutantpro...

Proteinphosphorylering ved en specifik rest spiller en væsentlig rolle i en bred vifte af cellulære processer. En forståelse af signaleringsnetværk kræver således identifikation af specifikke phosphoryleringssteder. Derudover bestemmer phosphoryleringsstedet virkningen på proteinfunktionen, fordi individuelle domæner i et protein har forskellige strukturer og funktioner. Aktiviteten af ​​nuklear faktor erythroid 2-relateret faktor 2 (Nrf2), en nøgle antioxidant transkriptionsfaktor, reguleres tovejs gennem phosphorylering på forskellige steder. Vores studier har fokuseret på kinaser, der katalyserer phosphoryleringen af ​​Nrf2. Spændingsresponsen af ​​Nrf2 mod oxidativ udfordring sker hurtigt, hovedsagelig gennem phosphorylering ved serin 40 og formidlet af proteinkinase C (PKC) -δ, som aktiverer Nrf2 3 , 4 . Omvendt katalyserer Fyn den inhibitoriske phosphorylering af Nrf2 ved tyrosin 568 for tæt kontrol af aktiviteten 5 . Den mest almindelige metode, der anvendes til at opdage phosphoryleringssteder, er væskekromatografi / massespektrometri (LC / MS) analyse. Hurtige og meget følsomme phosphoryleringssteder mapping data kan genereres på denne måde; Det har dog flere tekniske begrænsninger, der ofte genererer falsk-negative signaler. Dårlig sekvensdækning forekommer ofte i LC / MS analyse. For at identificere phosphoryleringssteder kræves der information om den maksimale aminosyredækning af et protein 6 . Proteolyse af proteinet af interesse med flere proteaser under fordøjelsestrinnet kan være til hjælp til forbedring af sekvensdækning. En anden hindring for identifikationen af ​​phosphoryleringsrester er det letforløb af phosphorsyre, som ofte observeres for serin- og threoninphosphorylerede peptider 6 , 7 . Labile phosphatdele er ofteFrigivet fra phosphopeptider under fragmenteringsprocessen 7 . Den anden mulighed, når man søger efter phosphoryleringssteder, bruger en peptidmikroarray metode. Det er muligt at screene for kinase-målstederne ved anvendelse af en mikroarraychip indeholdende peptidfragmenter afledt af et protein af interesse. På grund af udstyrets krav til produktion og påvisning af en microarray-chip betragtes peptid-mikroarray-metoden imidlertid tidskrævende og dyr. For at overvinde disse udfordringer kan et in vitro oligopeptidkompeterende kinaseassay anvendes til en proteinkinase med kendte genkendelsesmotiver. Hvis konsensusgenkendelsesmotivet for en kinase er etableret, kan der forudses formodede phosphoryleringssteder for et kandidatsubstrat, og autentiteten af ​​lokaliteterne kan valideres. Den mest overbevisende metode til denne procedure er at vise ophævelsen af ​​phosphorylering i et mutantprotein, hvori den predicteD rest er substitueret med en ikke-phosphorylerbar aminosyre ( dvs. serin eller threonin til alanin; tyrosin til phenylalanin). Imidlertid er produktion og isolering af mutante proteiner tidskrævende. Som et alternativ i den indledende fase af undersøgelsen er den konkurrencedygtige peptidkinaseanalyse ligetil og bekvem. Her beskriver vi en protokol for en in vitro -peptidkonkurrenceanalyse og til validering af phosphoryleringsstedet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Calbiochem, Nottingham, UK</td>
			<td>539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A1752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPK</td>
			<td>Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY</td>
			<td>14-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrf2 (WT)</td>
			<td>Abnova, Taipei City, Taiwan</td>
			<td>H00004780-P01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[&#947;-32P]-ATP</td>
			<td>PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA</td>
			<td>NEG502A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZblue staining reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu turbo DNA polymerase</td>
			<td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td>
			<td>600250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td>
			<td>200415-51</td>
			<td>Avoid multiple thaw and freezing cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td>
			<td>R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>L1704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Affymetrix, Santa Clara, CA</td>
			<td>11259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose LE</td>
			<td>iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea</td>
			<td>32034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit</td>
			<td>Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan</td>
			<td>QDF100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Bovogen Biologicals, Victoria, Australia</td>
			<td>BSA100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid glacial</td>
			<td>Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl alcohol</td>
			<td>Daejung Chemicals &#38; Metals, Siheung, South Korea</td>
			<td>5558-4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 7000</td>
			<td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td>
			<td>28-9558-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>165-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel dryer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>165-1746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dancing shaker</td>
			<td>FINEPCR, Seoul, Korea</td>
			<td>CR300</td>
			<td>The machine is needed for washing step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator/shakers</td>
			<td>N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea</td>
			<td>NB-205L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges</td>
			<td>LABOGENE, Seoul, Korea</td>
			<td>1730R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography columns</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>732-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oligopeptide competition assay for phosphorylation site determination

Proteinphosphorylering på bestemte steder bestemmer dets konformation og interaktion med andre molekyler. Proteinphosphorylering påvirker således biologiske funktioner og egenskaber hos cellen. For øjeblikket er den mest almindelige metode til opdagelse af phosphoryleringssteder ved hjælp af væskekromatografi / massespektrometri (LC / MS) analyse, en hurtig og følsom metode. Imidlertid frigives relativt labile phosphatdele ofte fra phosphopeptider under fragmenteringstrinnet, hvilket ofte giver falske negative signaler. I sådanne tilfælde ville et traditionelt in vitro kinase assay ved anvendelse af stedregistrerede mutanter være mere præcist, men denne metode er besværlig og tidskrævende. Derfor kan en alternativ metode ved anvendelse af peptidkonkurrence være fordelagtig. Konsensusgenkendelsesmotivet for 5&#39;-adenosinmonophosphat-aktiveret proteinkinase (AMPK) er blevet etableret 1 og blev valideret ved anvendelse af et positionsscanningpeptid bibliotek assAy 2 . Således kan AMPK-phosphoryleringssteder for et nyt substrat forudsiges og bekræftes af peptidkonkurrenceanalyserne. I denne rapport beskriver vi de detaljerede trin og procedurer for det in vitro oligopeptidkompeterende kinasassay ved at illustrere AMPK-medieret nuklear faktor erythroid 2-relateret faktor 2 (Nrf2) phosphorylering. For at autentificere phosphoryleringsstedet gennemførte vi et sekventielt in vitro kinase assay ved anvendelse af en site-specifik mutant. Samlet set tilvejebringer peptidkonkurrenceassayet en fremgangsmåde til screening af multiple potentielle phosphoryleringssteder og for at identificere steder til validering af phosphoryleringsstedsmutanterne.

Figur 1 og Figur 2 viser resultaterne fra gentagne forsøg i det tidligere rapporterede papir 8 . Tre forskellige oligopeptider med 10 rester efterligner de formodede AMPK-målsteder (# 1, 148-157 omfattende Ser153; # 2, 330-339 omfattende Ser335; og # 3, 553-562 omfattende Ser558) blev syntetiseret og anvendt som konkurrenter i den Vitro kinase assay. Fosforyleringen af ​​Nrf2 ved AMPK blev ...

Watch this Scientific Journal Video about Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination at JoVE.com

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Peptidkonkurrenceanalyser anvendes i vid udstrækning i en række molekylære og immunologiske eksperimenter. Dette papir beskriver en detaljeret fremgangsmåde til et in vitro oligopeptidkompeterende kinaseassay og de tilhørende valideringsprocedurer, som kan være nyttige til at finde specifikke phosphoryleringssteder.

Oligopeptidkonkurrenceanalyse for phosphoryleringsstedbestemmelse

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

En hurtig Laser Sondering Metode Letter ikke-invasive og Kontakt-fri Bestemmelse af Leaf Termiske egenskaber

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

Effektiv og site-specifikt antistof Mærkning af stamme-forfremmet azid-alkyn Cycloaddition

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

High Precision FRET på enkeltmolekyliveau for biomolekylstrukturbestemmelse

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Assay for fosforylering og mikrotubulus bindende sammen med lokalisering af Tau Protein i kolorektal cancerceller

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifikation af Cyclin-afhængig Kinase 1 specifikke fosforylering websteder ved en In Vitro -Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Identifikation af funktionelle Protein regioner gennem kimære Protein konstruktion

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Human perifert blod Neutrofile Isolation for at forhøre Parkinsons Associated LRRK2 Kinase Pathway ved at vurdere Rab10 fosforylering

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed mutagenese for In Vitro og i Vivo eksperimenter eksemplificeret med RNA interaktioner i Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for kvantitativ bestemmelse af palmitoyllation af hjernemembranproteiner

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Ikke-radioaktiv analyse til måling af polynukleotid phosphorylation af små nukleotid substrater

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...