Name: oligopeptide competition assay for phosphorylation site determination
Uploaded: 2017-05-18T14:00:00
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Ce travail a été soutenu par la subvention de la Fondation nationale de la recherche de Corée financée par le gouvernement coréen (MSIP) (n ° 2015R1A2A1A10052663 et n ° 2014M1A3A3A02034698).

1. Sécurité ATTENTION: Ce protocole utilise [γ- 32 P] -ATP pour évaluer l&#39;activité de l&#39;AMPK. Phosphorus-32 est un isotope radioactif, émettant en grande partie un rayonnement bêta. Comme la taille d&#39;une particule bêta est extrêmement petite, elle peut facilement pénétrer les vêtements et la peau. L&#39;exposition externe et interne au rayonnement bêta peut nuire à la santé humaine, y compris en causant des brûlures cutanées et des lésions tissulaires. ...

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	<li>Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK:+An+energy-sensing+pathway+with+multiple+inputs+and+outputs.">AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs.</a> Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).</li><li>Gwinn, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+phosphorylation+of+raptor+mediates+a+metabolic+checkpoint.">AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint.</a> Mol Cell. 30, 214-226 (2008).</li><li>Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Nrf2+at+Ser-40+by+protein+kinase+C+regulates+antioxidant+response+element-mediated+transcription.">Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription.</a> J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).</li><li>Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant-induced+modification+of+INrf2+cysteine+151+and+PKC-delta-mediated+phosphorylation+of+Nrf2+serine+40+are+both+required+for+stabilization+and+nuclear+translocation+of+Nrf2+and+increased+drug+resistance.">Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance.</a> J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).</li><li>Jain, A. K., Jaiswal, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK-3beta+acts+upstream+of+Fyn+kinase+in+regulation+of+nuclear+export+and+degradation+of+NF-E2+related+factor+2.">GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2.</a> J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).</li><li>Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry:+myths,+facts,+and+the+consequences+for+qualitative+and+quantitative+measurements.">Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements.</a> Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).</li><li>Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+analysis+of+phosphorylation+sites:+a+quick+guide+for+cell+biologists.">Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists.</a> Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).</li><li>Joo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+facilitates+nuclear+accumulation+of+Nrf2+by+phosphorylating+at+Serine+550.">AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550.</a> Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).</li><li>Sinclair, W. K., Holloway, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half-lives+of+some+radioactive+isotopes.">Half-lives of some radioactive isotopes.</a> Nature. 167 (4244), 365 (1951).</li><li>Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Src+and+RACK1+is+enhanced+by+activation+of+protein+kinase+C+and+tyrosine+phosphorylation+of+RACK1.">The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1.</a> J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).</li><li>Smith, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RACK1+interacts+with+filamin-A+to+regulate+plasma+membrane+levels+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).</li></ol>

Comme un moyen simple et pratique d&#39;évaluer l&#39;authenticité des sites de phosphorylation prédits médiés par AMPK, on ​​décrit ici un test de kinase in vitro qui peut être utilisé pour découvrir un site de phosphorylation spécifique en utilisant des peptides compétitifs et pour le vérifier en utilisant un mutant spécifique au site . Les données représentatives obtenues à partir du test d&#39;activité AMPK compétitif in vitro correspondent aux résultats d&#39;un essai en uti...

La phosphorylation des protéines à un résidu spécifique joue un rôle important dans un large éventail de processus cellulaires. Ainsi, une compréhension des réseaux de signalisation nécessite l&#39;identification de sites spécifiques de phosphorylation. En outre, le site de phosphorylation détermine l&#39;effet sur la fonction des protéines car les domaines individuels dans une protéine possèdent différentes structures et fonctions. L&#39;activité du facteur 2 du facteur nucléaire 2 (Nrf2), un facteur de transcription antioxydant clé, est régulée bidirectionnellement par la phosphorylation sur différents sites. Nos études ont porté sur les kinases qui catalysent la phosphorylation de Nrf2. La réponse au stress de Nrf2 contre le défi oxydatif se produit rapidement, principalement par la phosphorylation à la serine 40 et médiée par la protéine kinase C (PKC) -δ, qui active Nrf2 3 , 4 . Inversement, Fyn catalyse la phosphorylation inhibitrice de Nrf2 à la tyrosine 568 pour un contrôle strict de l&#39;activité 5 . La méthode la plus commune utilisée pour découvrir les sites de phosphorylation est l&#39;analyse par chromatographie liquide / spectrométrie de masse (LC / MS). Des données de cartographie de sites de phosphorylation rapides et très sensibles peuvent être générées de cette façon; Cependant, il présente plusieurs limitations techniques, générant souvent des signaux faussement négatifs. Une mauvaise couverture séquentielle se manifeste fréquemment dans l&#39;analyse LC / MS. Pour identifier les sites de phosphorylation, il est nécessaire d&#39;obtenir des informations sur la couverture maximale d&#39;acides aminés d&#39;une protéine 6 . La protéolyse de la protéine d&#39;intérêt avec plusieurs protéases pendant la phase de digestion peut être utile pour améliorer la couverture des séquences. Un autre obstacle à l&#39;identification des résidus de phosphorylation est la perte facile d&#39;acide phosphorique fréquemment observée pour les peptides phosphorylés par la serine et la thréonine 6 , 7 . Les fragments de phosphate labile sont souventLibéré à partir de phosphopeptides pendant le processus de fragmentation 7 . La deuxième option lors de la recherche de sites de phosphorylation est l&#39;utilisation d&#39;une méthode de microarray peptidique. Il est possible d&#39;examiner les sites cibles de la kinase en utilisant une puce de microarray contenant des fragments peptidiques dérivés d&#39;une protéine d&#39;intérêt. Cependant, en raison de l&#39;exigence d&#39;équipement pour la production et la détection d&#39;une puce de microarray, la méthode de microarray peptidique est considérée comme longue et coûteuse. Pour surmonter ces défis, on peut utiliser un test de kinase concurrent d&#39;oligopeptide in vitro pour une protéine kinase avec des motifs de reconnaissance connus. Si le motif de reconnaissance de consensus d&#39;une kinase est établi, on peut prédire les sites de phosphorylation putatifs d&#39;un substrat candidat et l&#39;authenticité des sites peut être validée. La méthode la plus convaincante pour cette procédure est de montrer l&#39;abrogation de la phosphorylation dans une protéine mutante dans laquelle le prédicteurD résidu est substitué par un acide aminé non phosphorylable ( c&#39;est-à-dire la sérine ou la thréonine à l&#39;alanine, la tyrosine à la phénylalanine). Cependant, la production et l&#39;isolement des protéines mutantes prend du temps. Comme alternative au stade initial de la recherche, le dosage compétitif de la peptide kinase est simple et pratique. Ici, nous décrivons un protocole pour un test de compétition peptidique in vitro et pour la validation du site de phosphorylation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Calbiochem, Nottingham, UK</td>
			<td>539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A1752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPK</td>
			<td>Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY</td>
			<td>14-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrf2 (WT)</td>
			<td>Abnova, Taipei City, Taiwan</td>
			<td>H00004780-P01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[&#947;-32P]-ATP</td>
			<td>PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA</td>
			<td>NEG502A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZblue staining reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu turbo DNA polymerase</td>
			<td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td>
			<td>600250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td>
			<td>200415-51</td>
			<td>Avoid multiple thaw and freezing cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td>
			<td>R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>L1704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Affymetrix, Santa Clara, CA</td>
			<td>11259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose LE</td>
			<td>iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea</td>
			<td>32034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit</td>
			<td>Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan</td>
			<td>QDF100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Bovogen Biologicals, Victoria, Australia</td>
			<td>BSA100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid glacial</td>
			<td>Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl alcohol</td>
			<td>Daejung Chemicals &#38; Metals, Siheung, South Korea</td>
			<td>5558-4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 7000</td>
			<td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td>
			<td>28-9558-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>165-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel dryer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>165-1746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dancing shaker</td>
			<td>FINEPCR, Seoul, Korea</td>
			<td>CR300</td>
			<td>The machine is needed for washing step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator/shakers</td>
			<td>N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea</td>
			<td>NB-205L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges</td>
			<td>LABOGENE, Seoul, Korea</td>
			<td>1730R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography columns</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>732-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oligopeptide competition assay for phosphorylation site determination

La phosphorylation des protéines sur des sites spécifiques détermine sa conformation et son interaction avec d&#39;autres molécules. Ainsi, la phosphorylation des protéines affecte les fonctions biologiques et les caractéristiques de la cellule. Actuellement, la méthode la plus commune pour découvrir les sites de phosphorylation est l&#39;analyse par chromatographie en phase liquide / spectrométrie de masse (LC / MS), une méthode rapide et sensible. Cependant, des fragments de phosphate relativement labiles sont souvent libérés à partir de phosphopeptides pendant l&#39;étape de fragmentation, ce qui donne souvent des signaux faussement négatifs. Dans de tels cas, un dosage traditionnel de kinase in vitro utilisant des mutants dirigés par site serait plus précis, mais cette méthode est laborieuse et prend beaucoup de temps. Par conséquent, une autre méthode utilisant une compétition peptidique peut être avantageuse. Le motif de reconnaissance consensus de 5 &#39;de la protéine kinase activée par l&#39;adénosine monophosphate (AMPK) a été établi 1 et a été validé à l&#39;aide d&#39;un culot de bibliothèque de peptides à balayage de positionAy 2 . Ainsi, les sites de phosphorylation AMPK pour un nouveau substrat pourraient être prédits et confirmés par les tests de compétition peptidique. Dans ce rapport, nous décrivons les étapes détaillées et les procédures pour le test de kinase concurrent par oligopeptide in vitro en illustrant la phosphorylation du facteur 2 associé au facteur 2 de l&#39;erythroid 2 (Nrf2) à médiation par AMPK. Pour authentifier le site de phosphorylation, nous avons effectué un dosage séquentiel de kinase in vitro en utilisant un mutant spécifique au site. Dans l&#39;ensemble, le test de compétition peptidique fournit une méthode pour cribler de multiples sites potentiels de phosphorylation et pour identifier les sites à valider par les mutants du site de phosphorylation.

La figure 1 et la figure 2 démontrent les résultats des expériences répétées dans le document précédemment rapporté 8 . Trois oligopeptides de 10 résidus différents imitant les sites cibles de l&#39;AMPK putatifs (# 1, 148-157 comprenant Ser153; # 2, 330-339 comprenant Ser335 et # 3, 553-562 comprenant Ser558) ont été synthétisés et utilisés comme concurrents dans le Test de kinase vit...

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Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Les tests de compétition peptidique sont largement utilisés dans une variété d&#39;expériences moléculaires et immunologiques. Cet article décrit une méthode détaillée pour un test de kinase concurrent par oligopeptide in vitro et les procédures de validation associées, qui peuvent être utiles pour trouver des sites de phosphorylation spécifiques.

Test de compétition Oligopeptide pour la détermination du site de phosphorylation

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

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