Name: oligopeptide competition assay for phosphorylation site determination
Uploaded: 2017-05-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למחקר של קוריאה מענק ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIP) (מס &#39;2015R1A2A1A10052663 ו No. 2014M1A3A3A02034698).

1. בטיחות זהירות: פרוטוקול זה משתמש [γ- 32 P] -ATP כדי להעריך את הפעילות של AMPK. זרחן -32 הוא איזוטופ רדיואקטיבי, המוביל בעיקר לקרינת בטא. מאז גודל של חלקיק בטא הוא קטן מאוד, זה יכול בקלות לחדור בגדים ועור. חשיפה חיצונית וחיצונית לקרינת...

<ol>
	<li>Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK:+An+energy-sensing+pathway+with+multiple+inputs+and+outputs.">AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs.</a> Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).</li><li>Gwinn, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+phosphorylation+of+raptor+mediates+a+metabolic+checkpoint.">AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint.</a> Mol Cell. 30, 214-226 (2008).</li><li>Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Nrf2+at+Ser-40+by+protein+kinase+C+regulates+antioxidant+response+element-mediated+transcription.">Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription.</a> J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).</li><li>Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant-induced+modification+of+INrf2+cysteine+151+and+PKC-delta-mediated+phosphorylation+of+Nrf2+serine+40+are+both+required+for+stabilization+and+nuclear+translocation+of+Nrf2+and+increased+drug+resistance.">Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance.</a> J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).</li><li>Jain, A. K., Jaiswal, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK-3beta+acts+upstream+of+Fyn+kinase+in+regulation+of+nuclear+export+and+degradation+of+NF-E2+related+factor+2.">GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2.</a> J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).</li><li>Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry:+myths,+facts,+and+the+consequences+for+qualitative+and+quantitative+measurements.">Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements.</a> Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).</li><li>Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+analysis+of+phosphorylation+sites:+a+quick+guide+for+cell+biologists.">Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists.</a> Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).</li><li>Joo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+facilitates+nuclear+accumulation+of+Nrf2+by+phosphorylating+at+Serine+550.">AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550.</a> Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).</li><li>Sinclair, W. K., Holloway, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half-lives+of+some+radioactive+isotopes.">Half-lives of some radioactive isotopes.</a> Nature. 167 (4244), 365 (1951).</li><li>Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Src+and+RACK1+is+enhanced+by+activation+of+protein+kinase+C+and+tyrosine+phosphorylation+of+RACK1.">The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1.</a> J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).</li><li>Smith, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RACK1+interacts+with+filamin-A+to+regulate+plasma+membrane+levels+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).</li></ol>

כדרך פשוטה ונוחה להעריך את האותנטיות של אתרי זרחון חזוי בתיווך AMPK, כאן אנו מתארים assay קינאז במבחנה שניתן להשתמש בהם כדי לגלות אתר זרחן ספציפי באמצעות פפטידים תחרותיים כדי לאמת אותו באמצעות מוטציה אתר ספציפי . הנתונים המייצגים המתקבלים מתוך מבחנה פעילות מ?...

חלבון זרחן ב שאריות מסוים ממלא תפקיד משמעותי במגוון רחב של תהליכים תאיים. לפיכך, הבנה של רשתות איתות דורשת זיהוי של אתרי זרחן ספציפיים. בנוסף, האתר זרחן קובע את ההשפעה על תפקוד החלבון, כי תחומים בודדים בתוך חלבון יש מבנים שונים פונקציות. פעילות הגורם הגרעיני erythroid 2 הקשורים גורם 2 (Nrf2), גורם נוגד חמצון מפתח, הוא מוסדר דו כיווני באמצעות זרחון באתרים שונים. המחקרים שלנו התמקדו קינאזות כי לזרז את זרחון של Nrf2. תגובת הלחץ של Nrf2 נגד אתגר חמצוני מתרחשת במהירות, בעיקר באמצעות זרחון ב serine 40 ו מתווכת על ידי חלבון קינאז C (PKC) -δ, אשר מפעיל Nrf2 3 , 4 . לעומת זאת, Fyn מזרז את זרחון מעכב של Nrf2 ב tyrosine 5עבור פיקוח הדוק על הפעילות. השיטה הנפוצה ביותר המשמשת לגלות אתרי זרחון הוא כרומטוגרפיה נוזלית / ספקטרומטריית מסה (LC / MS) ניתוח. מהיר וזמן רגיש זרחון באתר מיפוי נתונים ניתן להפיק בדרך זו; עם זאת, יש כמה מגבלות טכניות, לעתים קרובות יצירת אותות מזויפים שלילי. כיסוי רצף גרוע לעתים קרובות מתרחשת ניתוח LC / MS. כדי לזהות אתרי זרחון, מידע על כיסוי מקסימלי של חומצות אמינו של חלבון נדרש 6 . פרוטאוליזה של חלבון של עניין עם מספר פרוטאזות במהלך הצעד העיכול עשוי להיות לעזור בשיפור רצף הכיסוי. מכשול נוסף לזיהוי שאריות זרחון הוא אובדן של חומצה זרחתית כי הוא נצפה לעתים קרובות עבור serine ו threonine-phosphideslated פפטידים 6 , 7 . זרחן פוספט moieties הם לעתים קרובותשוחרר מ phosphopeptides במהלך תהליך הפיצול 7 . האפשרות השנייה בעת חיפוש אתרי זרחון היא באמצעות שיטת microarray פפטיד. ניתן לבדוק את אתרי היעד kinase באמצעות שבב microarray המכיל שברי פפטיד נגזר חלבון של עניין. עם זאת, בשל הדרישה הציוד לייצור וזיהוי שבב microarray, שיטת microarray פפטיד נחשב זמן רב ויקר. כדי להתגבר על אתגרים אלה, במבחנה oligopeptide- מתחרה assay קינאז יכול לשמש קינאז חלבון עם מוטיבים הכרה ידוע. אם מוטיב ההכרה של קונצנזוס של קינאז הוא הקימה, אתרי זרחון putative של המצע המועמד ניתן לחזות, ואת האותנטיות של האתרים ניתן לאמת. השיטה המשכנעת ביותר עבור הליך זה היא להראות את הביטול של זרחון בחלבון מוטנטי שבו תחזיתD שאריות מוחלפת בחומצת אמינו שאינה phosphorylatable ( כלומר, serine או threonine כדי alanine, tyrosine כדי פנילאלנין). עם זאת, ייצור ובידוד של חלבונים מוטנטים הוא זמן רב. כחלופה בשלב הראשוני של המחקר, assay פפטיד קינאז תחרותי הוא פשוט ונוח. כאן, אנו מתארים פרוטוקול עבור assay מבחנה במבחנה פפטיד ו עבור אימות של אתר זרחון.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Calbiochem, Nottingham, UK</td>
			<td>539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A1752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPK</td>
			<td>Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY</td>
			<td>14-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrf2 (WT)</td>
			<td>Abnova, Taipei City, Taiwan</td>
			<td>H00004780-P01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[&#947;-32P]-ATP</td>
			<td>PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA</td>
			<td>NEG502A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZblue staining reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu turbo DNA polymerase</td>
			<td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td>
			<td>600250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td>
			<td>200415-51</td>
			<td>Avoid multiple thaw and freezing cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td>
			<td>R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>L1704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Affymetrix, Santa Clara, CA</td>
			<td>11259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose LE</td>
			<td>iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea</td>
			<td>32034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit</td>
			<td>Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan</td>
			<td>QDF100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Bovogen Biologicals, Victoria, Australia</td>
			<td>BSA100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid glacial</td>
			<td>Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl alcohol</td>
			<td>Daejung Chemicals &#38; Metals, Siheung, South Korea</td>
			<td>5558-4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 7000</td>
			<td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td>
			<td>28-9558-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>165-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel dryer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>165-1746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dancing shaker</td>
			<td>FINEPCR, Seoul, Korea</td>
			<td>CR300</td>
			<td>The machine is needed for washing step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator/shakers</td>
			<td>N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea</td>
			<td>NB-205L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges</td>
			<td>LABOGENE, Seoul, Korea</td>
			<td>1730R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography columns</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>732-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oligopeptide competition assay for phosphorylation site determination

זרחון חלבון באתרים ספציפיים קובע את הקונפורמציה שלו ואת האינטראקציה עם מולקולות אחרות. לפיכך, זרחון חלבון משפיע על פונקציות ביולוגיות ומאפיינים של התא. כיום, השיטה הנפוצה ביותר לגילוי אתרי זירחון היא ניתוח כרומטוגרפי נוזלי / ספקטרומטריית מסה (LC / MS), שיטה מהירה ורגישה. עם זאת, זרחני פוספט זולה יחסית משוחררים לעתים קרובות phosphopeptides במהלך שלב פיצול, אשר לעתים קרובות מניב אותות שלילי שווא. במקרים כאלה, מסורתי assay קינאז במבחנה באמצעות מוטנטים מכוונים האתר יהיה מדויק יותר, אבל שיטה זו היא מייגעת זמן רב. לכן, שיטה חלופית באמצעות תחרות פפטיד עשוי להיות יתרון. מוטיב ההכרה הקונצנזוס של 5 &#39;אדנוזין monophosphate המופעל קינאז חלבון (AMPK) הוקם 1 ו תוקף באמצעות פוזיטיון סריקה פפטיד סריקה התחתAy. לפיכך, אתרי זרחון AMPK עבור מצע הרומן יכול להיות ניבא ואושר על ידי מבחני התחרות פפטיד. בדו&quot;ח זה, אנו מתארים את השלבים המפורטים ונהלים עבור במבחנה oligopeptide- מתחרה assay קינאז ידי המחשה AMPK בתיווך גורם גרעיני erythroid 2 הקשורים גורם 2 (Nrf2) זרחון. כדי לאמת את האתר זרחן, ביצענו רציף assay קינאז במבחנה באמצעות מוטציה באתר ספציפי. בסך הכל, assay התחרות פפטיד מספק שיטה למסך אתרי זרחן פוטנציאליים פוטנציאליים כדי לזהות אתרים לאימות על ידי מוטציות האתר זרחן.

איור 1 ואיור 2 מדגימים את התוצאות מניסויים חוזרים ונשנים בעיתון שדווח בעבר. שלושה oligopeptides 10-שאריות שונים מחקה את אתרי היעד AMPK putative (# 1, 148-157 המורכב SR153, # 2, 330-339 המורכב SR335, ו # 3, 553-562 המורכבת Ser558) היו מסונתז המשמשים מתחרים ...

Watch this Scientific Journal Video about Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination at JoVE.com

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

מבחני תחרות פפטיד נמצאים בשימוש נרחב במגוון של ניסויים מולקולריים וחיסונית. מאמר זה מתאר שיטה מפורטת עבור המבחנה oligopeptide- מתחרה assay קינאז ואת הליכי אימות הקשורים, אשר עשוי להיות שימושי כדי למצוא אתרי זרחן ספציפיים.

Oligopeptide Assay תחרות עבור זרחון קביעת האתר

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

ליזר מהיר גשוש שיטה מקלה על קביעת פולשני צור-חינם של תכונות תרמיות ליף

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

יעיל אתר ספציפי תיוג נוגדן ידי cycloaddition יזיד-אלקין קדם-Strain

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

דיוק גבוהה סריג ברמת מולקולה בודדת עבור קביעת מבנה ביומולקולה

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

וזמינותו של זרחון ואיגוד Microtubule יחד עם לוקליזציה של חלבון טאו בתאי סרטן המעי הגס

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

זיהוי של קינאז תלוי-Cyclin 1 אתרי זירחון ספציפיים על-ידי קינאז במבחנה Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

זיהוי של חלבון פונקציונלי אזורים באמצעות חלבון Chimeric בנייה

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

דם היקפי הדם נויטרופילים בידוד עבור חקירת פרקינסון הקשורים LRRK2 קינאז מסלול על ידי הערכת Rab10 זירחון

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Acyl-PEGyl החליפין ג'ל שינוי שיטת להגדרה כמותית של פלמילציה של חלבונים קרום המוח

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

תרגום לא רדיואקטיבי למדוד פוספורילציה פולינוקלאוטיד של מצעי נוקלאוטיד קטנים

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...