Name: oligopeptide competition assay for phosphorylation site determination
Uploaded: 2017-05-18T14:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Nazionale di Ricerca della Corea finanziata dal governo coreano (MSIP) (No. 2015R1A2A1A10052663 e No. 2014M1A3A3A02034698).

1. Sicurezza ATTENZIONE: Questo protocollo utilizza [γ- 32 P] -ATP per valutare l&#39;attività di AMPK. Fosforo-32 è un isotopo radioattivo, che emette in gran parte le radiazioni beta. Poiché la dimensione di una particella beta è estremamente piccola, può facilmente penetrare l&#39;abbigliamento e la pelle. L&#39;esposizione esterna ed interna a radiazioni beta possono essere dannose per la salute umana, anche causando ustioni cutanee e danni ai tessuti. <ol><li> Eseguir...

<ol>
	<li>Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK:+An+energy-sensing+pathway+with+multiple+inputs+and+outputs.">AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs.</a> Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).</li><li>Gwinn, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+phosphorylation+of+raptor+mediates+a+metabolic+checkpoint.">AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint.</a> Mol Cell. 30, 214-226 (2008).</li><li>Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Nrf2+at+Ser-40+by+protein+kinase+C+regulates+antioxidant+response+element-mediated+transcription.">Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription.</a> J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).</li><li>Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant-induced+modification+of+INrf2+cysteine+151+and+PKC-delta-mediated+phosphorylation+of+Nrf2+serine+40+are+both+required+for+stabilization+and+nuclear+translocation+of+Nrf2+and+increased+drug+resistance.">Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance.</a> J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).</li><li>Jain, A. K., Jaiswal, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK-3beta+acts+upstream+of+Fyn+kinase+in+regulation+of+nuclear+export+and+degradation+of+NF-E2+related+factor+2.">GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2.</a> J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).</li><li>Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry:+myths,+facts,+and+the+consequences+for+qualitative+and+quantitative+measurements.">Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements.</a> Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).</li><li>Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+analysis+of+phosphorylation+sites:+a+quick+guide+for+cell+biologists.">Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists.</a> Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).</li><li>Joo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+facilitates+nuclear+accumulation+of+Nrf2+by+phosphorylating+at+Serine+550.">AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550.</a> Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).</li><li>Sinclair, W. K., Holloway, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half-lives+of+some+radioactive+isotopes.">Half-lives of some radioactive isotopes.</a> Nature. 167 (4244), 365 (1951).</li><li>Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Src+and+RACK1+is+enhanced+by+activation+of+protein+kinase+C+and+tyrosine+phosphorylation+of+RACK1.">The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1.</a> J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).</li><li>Smith, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RACK1+interacts+with+filamin-A+to+regulate+plasma+membrane+levels+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).</li></ol>

Come un modo semplice e conveniente per valutare l&#39;autenticità dei siti di fosforilazione previsti mediati da AMPK, qui descriviamo un dosaggio in vitro di chinasi che può essere utilizzato per scoprire uno specifico sito di fosforilazione utilizzando peptidi competitivi e per verificarlo usando un mutante specifico del sito . I dati rappresentativi ottenuti dal saggio di attività AMPK competitivo in vitro hanno raggiunto i risultati di un saggio utilizzando una proteina mutante diretta sul sito...

La fosforilazione della proteina in un residuo specifico svolge un ruolo significativo in una vasta gamma di processi cellulari. Pertanto, una comprensione delle reti di segnalazione richiede l&#39;individuazione di specifici siti di fosforilazione. Inoltre, il sito di fosforilazione determina l&#39;effetto sulla funzione proteica perché i singoli domini all&#39;interno di una proteina possiedono strutture e funzioni diverse. L&#39;attività del fattore nucleare eritroide 2 correlato 2 (Nrf2), un fattore chiave di trascrizione antiossidante, è bi-direzionale regolata attraverso la fosforilazione in diversi siti. I nostri studi si sono concentrati sulle chinasi che catalizzano la fosforilazione di Nrf2. La risposta dello stress di Nrf2 contro la sfida ossidativa si verifica rapidamente, principalmente attraverso la fosforilazione in serina 40 e mediata da proteina chinasi C (PKC) -δ, che attiva Nrf2 3 , 4 . Al contrario, Fyn catalizza la fosforilazione inibitoria di Nrf2 alla tirosina 568 per un controllo stretto dell&#39;attività 5 . Il metodo più comune per scoprire i siti di fosforilazione è la cromatografia liquida / analisi di spettrometria di massa (LC / MS). I dati di mappatura del sito di fosforilazione rapida e altamente sensibile possono essere generati in questo modo; Tuttavia, ha diverse limitazioni tecniche, generando spesso segnali falsi negativi. Nella LC / MS analisi si riscontra frequentemente la scarsa sequenza di sequenza. Per identificare i siti di fosforilazione è richiesta informazioni sulla copertura ottimale di aminoacidi di una proteina 6 . La proteolisi della proteina di interesse con diverse proteasi durante la fase di digestione può aiutare a migliorare la copertura delle sequenze. Un altro ostacolo per l&#39;identificazione dei residui di fosforilazione è l&#39;immediata perdita di acido fosforico spesso osservata per i peptidi 6 , 7 , serine e treonina fosforilati. Le parti di fosfati Labile sono spessoRilasciato da fosfopeptidi durante il processo di frammentazione 7 . La seconda opzione nella ricerca di siti di fosforilazione sta utilizzando un metodo di microarray peptidico. È possibile schermare i siti di destinazione di chinasi usando un chip di microarray contenente frammenti peptidi derivanti da una proteina di interesse. Tuttavia, a causa del requisito di attrezzatura per la produzione e la rilevazione di un chip microarray, il metodo del microarray peptide è considerato tempo e costoso. Per superare queste sfide, un test di chinasi in concorrenza in vitro con oligopeptide può essere utilizzato per una chinasi di proteina con motivi riconosciuti di riconoscimento. Se si stabilisce il motivo di riconoscimento del consenso di una chinasi, si possono prevedere siti di fosforilazione supposto di un substrato candidato e l&#39;autenticità dei siti può essere convalidata. Il metodo più convincente per questa procedura è quello di mostrare l&#39;abrogazione della fosforilazione in una proteina mutante in cui la predizioneD è sostituito da un aminoacido non fosforilabile ( vale a dire, sierina o treonina ad alanina, tirosina alla fenilalanina). Tuttavia, la produzione e l&#39;isolamento delle proteine ​​mutanti richiedono molto tempo. Come alternativa alla fase iniziale della ricerca, il concorso di peptide chinasi competitivo è semplice e conveniente. Qui descriviamo un protocollo per un test di concorrenza peptidico in vitro e per la convalida del sito di fosforilazione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Calbiochem, Nottingham, UK</td>
			<td>539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A1752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPK</td>
			<td>Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY</td>
			<td>14-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrf2 (WT)</td>
			<td>Abnova, Taipei City, Taiwan</td>
			<td>H00004780-P01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[&#947;-32P]-ATP</td>
			<td>PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA</td>
			<td>NEG502A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZblue staining reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu turbo DNA polymerase</td>
			<td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td>
			<td>600250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td>
			<td>200415-51</td>
			<td>Avoid multiple thaw and freezing cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td>
			<td>R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>L1704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Affymetrix, Santa Clara, CA</td>
			<td>11259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose LE</td>
			<td>iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea</td>
			<td>32034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit</td>
			<td>Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan</td>
			<td>QDF100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Bovogen Biologicals, Victoria, Australia</td>
			<td>BSA100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid glacial</td>
			<td>Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl alcohol</td>
			<td>Daejung Chemicals &#38; Metals, Siheung, South Korea</td>
			<td>5558-4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 7000</td>
			<td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td>
			<td>28-9558-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>165-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel dryer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>165-1746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dancing shaker</td>
			<td>FINEPCR, Seoul, Korea</td>
			<td>CR300</td>
			<td>The machine is needed for washing step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator/shakers</td>
			<td>N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea</td>
			<td>NB-205L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges</td>
			<td>LABOGENE, Seoul, Korea</td>
			<td>1730R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography columns</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>732-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oligopeptide competition assay for phosphorylation site determination

La fosforilazione della proteina in determinati siti determina la sua conformazione e l&#39;interazione con altre molecole. Così, la fosforilazione delle proteine ​​influenza le funzioni e le caratteristiche biologiche della cellula. Attualmente, il metodo più comune per la scoperta dei siti di fosforilazione è mediante analisi liquida / cromatografia / spettrometria di massa (LC / MS), un metodo rapido e sensibile. Tuttavia, le parti fosfatiche relativamente labili sono spesso rilasciate dai fosfopeptidi durante la fase di frammentazione, che spesso produce segnali falsi negativi. In questi casi, un test tradizionale in vitro di chinasi con mutanti localizzati sul sito sarebbe più preciso, ma questo metodo è laborioso e richiede tempo. Pertanto, un metodo alternativo che utilizza concorrenza peptidica può essere vantaggioso. Il motivo di riconoscimento del consenso di 5 &#39;adenosina monofosfato-attivato proteina chinasi (AMPK) è stato stabilito 1 e è stato convalidato utilizzando una scansione di posizionamento peptide libreria asinoAy 2 . Così, i siti di fosforilazione AMPK per un nuovo substrato potrebbero essere predittuti e confermati dai test di concorrenza peptidica. In questa relazione descriviamo le fasi e le procedure dettagliate per il test di chinasi in concorrenza con oligopeptide in vitro illustrando la fosforilazione del fattore 2 (Nrf2) correlata con eritroide 2 a fattore nucleare mediata da AMPK. Per autenticare il sito di fosforilazione, abbiamo effettuato un test sequenziale in vitro di chinasi usando un mutante specifico del sito. Nel complesso, il test di concorrenza peptide fornisce un metodo per la screening di più potenziali siti di fosforilazione e per identificare siti per la convalida da parte dei mutanti del sito di fosforilazione.

La Figura 1 e la Figura 2 mostrano i risultati di esperimenti ripetuti nella carta precedentemente riportata 8 . Sono stati sintetizzati tre differenti oligopeptidi di 10 residui che imitavano i siti di destinazione AMPK (# 1, 148-157 comprendenti Ser153; # 2, 330-339 composti da Ser335 e # 3, 553-562 composti da Ser558). Vitro chinasi. La fosforilazione di Nrf2 da AMPK è stata notevolmente dimi...

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Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

I test di concorrenza del peptide sono ampiamente usati in una varietà di esperimenti molecolari ed immunologici. Questo documento descrive un metodo dettagliato per un test in vitro di oligopeptide-concorrenza e le relative procedure di convalida, che possono essere utili per trovare siti specifici di fosforilazione.

Analisi della concorrenza oligopeptide per la determinazione del sito di fosforilazione

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

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