Name: quantifying abdominal pigmentation in drosophila melanogaster
Uploaded: 2017-06-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af National Science Foundation tildeler IOS-1256565 og IOS-1557638 til AWS. Vi takker Patricia Wittkopp og tre anonyme korrekturlæsere for deres nyttige kommentarer til en tidligere version af dette papir.

1. Prøvemontering BEMÆRK: Opbevar døde fluer i 70% ethanol i vand før billeddannelse. <ol><li> Hæld 10 ml 1,25% agar opløst i kogende vand i en 60 mm x 15 mm petriskål, og lad den indstille. </li><li> Under et dissekeringsmikroskop skal du bruge et par fint punktpinde til at lave en ~ 20 mm ong, 2 mm bred, 1 mm dyb rille i gelens overflade. Ved hjælp af fine tang, indlejrer du den ventrale side af en voksenflyv i rillen med den dorsale side af fluen, der rager over gelen. BE...

Denne metode muliggør den præcise, hurtige og gentagelige opsamling af pigmenteringsdata i en kvantitativ form, som er egnet til flere downstream-analyser. Metoden er blevet brugt til at indhente data om effekten af ​​temperatur på abdominal pigmentering i en isogen fluevogn. Metoden kan dog anvendes i fremad genetik undersøgelser for at identificere gener, der ligger til grund for pigmenteringsforskelle mellem individer, populationer eller arter eller omvendte genetiske undersøgelser for at undersøge virkning...

Pigmentering viser enorm fænotypisk variation mellem arter, populationer og individer, og endog inden for enkeltpersoner under ontogeni 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Selv om der er utallige studier af pigmentering i en bred vifte af dyr, er pigmentering måske bedst studeret i Drosophila melanogaster , hvor den fulde kraft af molekylær genetik er blevet brugt til at belyse de udviklingsmæssige og fysiologiske mekanismer, som regulerer pigmentering og hvordan disse mekanismer udvikler sig 1 , 6 . Meget er kendt om generne der regulerer den biokemiske syntese af pigmenter i D. melanogaster 7 , 8 og generne der styrer den tidsmæssige og rumlige diFordeling af denne biosyntese 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Endvidere har genetisk kortlægning identificeret de genetiske lokaliteter, der ligger til grund for intra- og interspecifikke forskelle i pigmentering i D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 . Sammenhængen mellem pigmentering og pleiotropiske træk, såsom adfærd 18 , 19 og immunitet 19 , 20 , er også blevet undersøgt, ligesom den adaptive betydning af pigmenteringsmønstre 15 , 21 , 22 . Som sådan er pigmentering i D. melanogaster fremkommet som en kraftfuld, men simpel mOdel for udvikling og udvikling af komplekse fænotyper. Pigmentering i voksen D. melanogaster er karakteriseret ved forskellige melaniseringsmønstre over hele kroppen, især på vingerne og dorsale thorax og mave. Det er pigmenteringen af ​​hver kutikulær plade (tergit) på dorsalunderlivet, der dog har fået mest forskningsopmærksomhed. Der er betydelig variation i denne pigmentering ( figur 1A- F ) på grund af både genetiske 17 , 23 og miljø 24 , 25 faktorer. Kirtiklen af ​​en abdominal tergit består af forreste og bageste udviklingsrum ( figur 1G ), som hver især kan opdeles yderligere, afhængig af pigmentering og udsmykning 26 . Det forreste rum indeholder seks krydderierTyper (a1-a6), og det bageste rum indeholder tre (p1-p3) ( figur 1G ). Af disse foldes p1-, p2- og a1-kutiklen typisk under tergitten i ustrakte abdomener, så de er skjulte. Den pålideligt synlige kutikula er kendetegnet ved et band med tung pigmentering, heri omtalt som et &quot;pigmentbånd&quot;, der består af kutikeltyper a4 (håret med moderat børstehår) og a5 (håret med store børster) med bandets bageste kant Mere intenst pigmenteret end den forreste kant ( figur 1G ). Foran for dette band er en region med let pigmenteret håret kutikula, som har børster bagtil (a3), men ikke anteriorly (a2). Variation i pigmentering mellem fluer observeres i både intensiteten af ​​pigmentering og i bredden af ​​pigmentbåndet. Generelt er variation størst i de mest bageste segmenter (mavesegmenterne 5, 6 og 7) og er lavere i de mere fremre segmenter (abdominal seGment 3 og 4) 24 . Derudover er der en seksuel dimorfisme i D. melanogaster pigmentering, hvor mænd generelt har fuldt pigmenteret femte og sjette buk tergitter ( figur 4C ). I de fleste studier af abdominal pigmentering i D. melanogaster er pigmentering blevet behandlet som et kategorisk eller ordinært træk, idet mønsteret måles kvalitativt 27 , 28 , 29 eller semikvantitativt på en skala 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 31 , 32 , 33 , 34 , 3536 , 37 . Disse metoder har uundgåeligt en mangel på præcision, og fordi de er afhængige af den subjektive vurdering af pigmentering, er det svært at sammenligne dataene i tværs af undersøgelserne. Flere forfattere har kvantificeret de rumlige dimensioner af pigmentering 38 , 39 , intensiteten af ​​pigmentering af en bestemt kutikeltype 23 , 25 , 39 , 40 eller den gennemsnitlige intensitet af pigmentering over buk-tergitten som helhed 41 , 42 , 43 . Ikke desto mindre måler disse kvantificeringsmetoder ikke både intensiteten og den rumlige fordeling af abdominal pigmentering samtidigt og derfor ikke fanger nuancerne af, hvordan pigmentering varierer over abdOminal tergite. Desuden kræver adskillige af disse kvantificeringsmetoder 38 , 41 , 42 , 43 dissektionen og montering af abdominal cuticle. Dette er både tidskrævende og ødelægger prøven, hvilket gør den utilgængelig til yderligere morfologiske analyser. Da forståelsen af ​​udvikling og udvikling af abdominal pigmentering fordybes, vil mere sofistikerede værktøjer til hurtigt og præcist måle både rumlig fordeling og intensitet af pigmentering kræves. Det overordnede mål med denne metode er at udnytte digital billedanalyse for at opnå en replikerbar og mere præcis måling af abdominal pigmentering i D. melanogaster . Metoden omfatter tre faser. For det første er den voksne flyve ikke destruktivt monteret, og et digitalt billede af dorsalunderlivet er taget. For det andet bruger brugeren en ImageJ-makroDefinerer en anterior-posterior stribe af pixels, der strækker sig fra forenden af ​​a2-cuticleen til den bageste af a5-kutikulaen (grøn boks, figur 1G ) på både det tredje og det fjerde abdominalsegment. Den gennemsnitlige pixelværdi på tværs af bredden af ​​denne strimmel ekstraheres derefter langs sin længdeakse, hvilket frembringer en profil, der fanger den rumlige fordeling og intensiteten af ​​pigmentering, når den ændrer sig fra den forreste til den bageste del af tergitten. For det tredje bruges et R-script til at beskrive pigmenteringsprofilen matematisk ved hjælp af en kubisk spline. R-scriptet anvender derefter spline og dets første og andet derivat til at ekstrahere bredden af ​​a2-a5-cuticleen, pigmentbåndets bredde og de maksimale og minimale pigmenteringsniveauer. Metoden kvantificerer derfor både de rumlige egenskaber og dybden af ​​abdominal pigmentering. Denne metode kvantificerer pigmenteringen af ​​den tredje og fjerde abdominal tergit,Som har været i fokus for mange tidligere studier 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , enten udelukkende eller i kombination med mere posterior tergitter. Selvom den er mindre variabel end den femte og den sekste abdominale tergitter, er den tredje og fjerde tergit ikke fuldstændigt pigmenteret hos mænd, så denne protokol kan anvendes til både mænd og kvinder. Ikke desto mindre, som vist her, kan protokollen anvendes til måling af pigmentering i femte og sjette buk tergitter hos kvinder. Endvidere bør mindre modifikationer af de skrifter, der anvendes til ekstraktion af pigmenteringsprofilens karakteristika, tillade, at metoden anvendes til at kvantificere variationen i pigmentering i en lang række andreorganismer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Biology Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MDG41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gooseneck Cold Light Source</td>
			<td>Schott</td>
			<td>ACE 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Acquisition Control Software</td>
			<td>Micro-Manager v1.3.20</td>
			<td></td>
			<td>https://micro-manager.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td>R 3.3.2</td>
			<td></td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>LEDWE-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimeter</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>Fluke 75 Series II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Celltreat Scientific Products</td>
			<td>229663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer</td>
			<td>Klarman Rulings, Inc.</td>
			<td>KR-867</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying abdominal pigmentation in drosophila melanogaster

Pigmentering er et morfologisk simpelt men meget variabelt træk, som ofte har adaptiv betydning. Det har tjent udbredt som en model til forståelse for udviklingen og udviklingen af ​​morfologiske fænotyper. Abdominal pigmentering i Drosophila melanogaster har været særlig nyttig, så forskere kan identificere de loci, der ligger til grund for inter- og intraspecifikke variationer i morfologi. Hidtil har D. melanogaster abdominale pigmentering i vid udstrækning blevet analyseret kvalitativt gennem scoring snarere end kvantitativt, hvilket begrænser formerne for statistisk analyse, som kan anvendes på pigmenteringsdata. Dette værk beskriver en ny metode, der muliggør kvantificering af forskellige aspekter af abdominal pigmenteringsmønster af voksen D. melanogaster . Protokollen omfatter prøvemontering, billedoptagelse, dataudvinding og analyse. Al den software, der bruges til makroer til billedoptagelse og analysefunktionerSkrevet til open source image analyse. Fordelen ved denne fremgangsmåde er evnen til præcist at måle pigmenteringskarakteristika ved anvendelse af en metode, der er stærkt reproducerbar på tværs af forskellige billeddannelsessystemer. Selv om teknikken er blevet brugt til at måle variation i tergalpigmenteringsmønstre af voksen D. melanogaster , er metoden fleksibel og bredt anvendelig på pigmenteringsmønstre i utallige forskellige organismer.

Protokollen blev brugt til at undersøge virkningen af ​​opdrætstemperatur på abdominal pigmentering. Tidligere undersøgelser har vist, at en stigning i udviklingstemperaturen resulterer i et fald i spredningen af ​​abdominal pigmentering hos flere arter af Drosophila , herunder D. melanogaster 30 , 32 . Specifikt falder pigmentens omfang (bredden af ​​pigmentbåndet) i mave-tergitter 3 og 4 fra 1...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Dette arbejde præsenterer en metode til hurtigt og præcist at kvantificere abdominal pigmentering af Drosophila melanogaster ved hjælp af digital billedanalyse . Denne metode strømlinierer procedurerne mellem fænotypeindsamling og dataanalyse og omfatter prøvemontering, billedoptagelse, pixelværdisekstraktion og egenskabsmåling.

Kvantificering af abdominal pigmentering i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Mærkning af mitokondrie-DNA Replication i Drosophila Adult Ovarier af Edu Farvning

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Høj fedt diæt fodring og High Throughput Triacylglyceride Assay i Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Høj opløsning fluorescerende In Situ hybridisering i Drosophila fostre og væv ved hjælp af Tyramide Signal forstærkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

Måling af motion niveauer i Drosophila melanogaster ved hjælp af den roterende motion kvantificering systemet (HENV)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

Trædemølle: Interval Træning protokol for forsigtigt induceret øvelse i Drosophila melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Rensning af lav-rigelige celler i Drosophila visuelle System

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

En analyse til kvantificering af protein-RNA-binding i bakterier

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In vivo funktionel undersøgelse af sygdoms associerede sjældne humane varianter ved hjælp af Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In vivo fremad genetisk skærm for at identificere nye neuroprotektive gener i Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

En robust polymerase kæde reaktions baseret analyse til kvantificering af cytosin-guanin-guanin-Trinucleotid gentages i skrøbelig X mental retardering-1 gen

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...