Name: glucose uptake measurement and response to insulin stimulation in in vitro cultured human primary myotubes
Uploaded: 2017-06-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes at JoVE.com

Författarna bekräftar Anne Charrié vid Radiobiology-tjänsten (Lyon-Sud sjukhus) och Fond National Suisse (FNS) för deras ekonomiska stöd.

1. Framställning av cellkulturmedia och lösningar <ol><li> Framställning av odlingsmedium <ol><li> Preparera proliferationsmedium (PM) genom att komplettera Ham&#39;s F-10-medium med glutamin (2 mM), penicillin / streptomycin (5 | ig / ml slutlig), 2% fetalt kalvserum (FCS) och 2% serumutbyte. </li><li> Förbered differentieringsmedium (DM) genom att komplettera Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) med glutamin (2 mM), penicillin / streptomycin (5 μg / mL slutlig) och 2% FCS. </li></ol></li...

Glukosupptagning är en nyckelbiologisk mätning för att testa aktivatorer eller hämmare på cellodling och hur de påverkar glukosanvändningen och cellens förmåga att reagera på insulin. Metoden som beskrivs här har visat sig vara snabb och pålitlig och har använts i många studier med användning av primära myotuber från friska försökspersoner och / eller metaboliskt drabbade patienter 6 , 7 , 10 , <su...

Skelettmuskel är den största glukosdepositionen hos däggdjur och bidrar till stor del till glukoshomeostas. Denna insulinreaktiva vävnad är den primära platsen för glukosupptaget som utlöses av insulinstimulering 1 . I typ 2-diabetes observeras insulinresistens i flera vävnader, inklusive skelettmuskler, och leder till över normal blodglukoskoncentration. Det är således av stor betydelse att bestämma nivån på insulinkänsligheten hos denna vävnad och dess celler, oavsett om syftet är att karakterisera en defekt hos ett individ eller att utvärdera effektiviteten av en behandling som avser att förbättra den. Hos människor eller djur är standardmetoden för guld för att bedöma insulinkänslighet hyperinsulinemisk-euglykemisk klämma. Infördes av DeFronzo i 1979 2 och modifierad sedan 3 , 4 då tillåter metoden att kvantifiera hela kroppen aNd vävnad insulinresponsivitet mätt som graden av glukos som ska perfusioneras under insulinstimulering för att upprätthålla normal blodglukoskoncentration. Insulinkänslighetsutforskning kan även utföras på cellnivå med in vitro- muskelmodeller, och mätning av glukosupptagningshastigheter är fortfarande ett effektivt och pålitligt verktyg för att kvantifiera cellets biologiska respons till insulinstimulering 5 , 6 , 7 . I själva verket kvantifierar mätningen av glukosupptagning det cellbiologiska svaret på insulinstimulering, från bindning av insulin till dess receptor för translokation av GLUT4-berikade vesiklar och innefattande intracellulära signalerings- och fosforyleringskaskader 8 . Detta är av stort intresse med humana prover, eftersom differentierade myotubes upprätthåller många egenskaper hos donatorfenotypen, inklusive metaboliska egenskaperSjukdomar och störningar observerade i patienten 9 , 10 , 11 , 12 . Myotubesna visar strukturella, metaboliska och fenotypiska likheter med skelettmuskeln 13 , 14 , innefattande uttrycket av glukostransportörer 15 och cellinsulin-signaleringsmaskinen 16 . Således är mätning av glukosupptagningen i primära myotubes av betydelse för att karakterisera en donors muskelfenotyp eller undersöka effekten av ett ingrepp (läkemedel, näring eller fysisk aktivitet) på insulinkänsligheten i muskelcellen. Mätningen av glukosupptagning på odlade myotubes är också ett pålitligt verktyg vid utförande av experiment som modifierar insulinkänslighet 17 , 18 . In vitro </Em&gt; -modellen är lämplig för test av några föreningar som kan förbättra insulinreaktiviteten eller kan förhindra eller reversera förvärvat eller inducerat insulinresistens 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för kultur och differentierar mänskliga myotubes och att mäta upptagningshastigheter för cellglukos. Metoden är tillämplig på vilken som helst källa av prekursorceller från mänskliga muskler, oavsett om de kommer från in-lab preparat, samarbete eller kommersiellt tillgängliga leverantörer. Immortaliserade muskelcellinjer, som C2C12 och L6, respektive från mus och råttor, kan också användas för mätning av glukosupptagning med detta protokoll 7 . Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för att kvantifiera frekvenserna i basala och insulinstimulerade tillstånd med radiomärkt [ 3 H] 2dG. THan använder en märkt glukosanalog medger noggrann bestämning av glukosintaget med reducerat utgångsmaterial, ett vanligt tillstånd vid arbete med primära celler. Den modifierade glukosmolekylen kan inte komma in i metaboliska vägar, och ackumuleras således i cellen, vilket möjliggör tillförlitlig kvantifiering via total cellradioaktivitet. Experimentella förhållanden innefattar användning av en glukostransportinhibitor (cytokalasin B), och mätningar utförs med och utan insulin. Denna kombination möjliggör bestämning av glukos aktiva inträdeshastigheter, såväl som beräkningen av veckbyte för insulinresponsindex. Metoden presenteras med en dos insulin under en enda inkubationstid, men protokollet kan lätt modifieras för dosrespons eller tidskursförsök 12 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="868">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Human primary muscle cell</td>
			<td style="width:171px;">In house preparation from human skeletal muscle biopsies</td>
			<td style="width:180px;">In house preparation from human skeletal muscle biopsies</td>
			<td style="width:257px;">If not available, use commercial source</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Human primary muscle cell</td>
			<td style="width:171px;">Promocell</td>
			<td>C-12530</td>
			<td style="width:257px;">Should be cultured with associated media C23060 and C23061</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">6-well plate</td>
			<td style="width:171px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">356400</td>
			<td style="width:257px;">BioCoat Collagen I Multiwell Plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0145-500</td>
			<td style="width:257px;">1 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Glutamine</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">X0551-100</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">penicilin/streptomycin 100x</td>
			<td style="width:171px;">Thermo fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15140122</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Serum substitute UltroserG</td>
			<td style="width:171px;">Pall France</td>
			<td style="width:180px;">15950.017</td>
			<td style="width:257px;">serum substitute in text</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DMEM low glucose</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0064-500</td>
			<td style="width:257px;">1 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td style="width:171px;">Eurobio</td>
			<td style="width:180px;">CVFSVF00-01</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0625-500</td>
			<td style="width:257px;">Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Insulin solution human</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">I9278</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">2-deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">D6134</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Albumin bovine</td>
			<td style="width:171px;">euromedex</td>
			<td style="width:180px;">04-100-812-E</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">fatty acid-free BSA</td>
			<td style="width:171px;">Roche</td>
			<td style="width:180px;">10,775,835,001</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">palmitate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">P0500</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">NET328A001MC</td>
			<td style="width:257px;">Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">c2743</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PICO PRIAS VIAL 6ml</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">6000192</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ultima gold MW CA&#160;</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td>6013159</td>
			<td style="width:257px;">scintillation liquid</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">b&#234;ta counter&#160;</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">2900TR</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glucose uptake measurement and response to insulin stimulation in in vitro cultured human primary myotubes

Skelettmuskel är den största glukosdepositionen hos däggdjur och bidrar till stor del till glukoshomeostas. Bedömning av insulinkänsligheten hos muskelceller är av stor betydelse för alla studier som är dedikerade till att undersöka glukosmetabolism och karakteriserande metaboliska förändringar. I muskelceller translaterar glukostransportör typ 4 (GLUT4) proteiner till plasmamembranet som svar på insulin, vilket möjliggör massiv inträde av glukos i cellen. Muskelcellernas förmåga att reagera på insulin genom att öka graden av glukosupptagning är en av standardavläsningarna för att kvantifiera muskelcellens känslighet för insulin. Mänskliga primära myotubes är en lämplig in vitro- modell, eftersom cellerna bibehåller många egenskaper hos donorfenotypen, inklusive insulinkänslighet. Denna in vitro- modell är också lämplig för testet av några föreningar som kan påverka insulinresponsen. Mätningar av glukosupptagningshastigheten i differentierade myotubes reflekterarInsulinkänslighet. I denna metod odlas humana primära muskelceller in vitro för erhållande av differentierade myotubes, och upptagningshastigheter för glukos med och utan insulinstimulering mäts. Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för att kvantifiera passiva och aktiva glukostransporthastigheter med radiomärkt [3H] 2-deoxi-D-glukos ([ 3 H] 2dG). Beräkningsmetoder tillhandahålls för att kvantifiera aktiva basala och insulinstimulerade hastigheter, såväl som stimuleringsvikt.

På dag 3 når myoblaster sammanflödet ( Figur 1A ). Myoblasterna i detta skede är typiskt mononukleerade. Medium ändrades och på dag 8 fullbordades differentiering ( Figur 1B ) (protokoll avsnitt 2). Efter 5 dagars differentiering är myotubes inriktade och typiskt polynukleerade. Humana primära myotubes utsattes för en palmitat eller en BSA-enbart behandling före mätning av glukosupptagningshastighet. Celler inkuberade...

Watch this Scientific Journal Video about Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes at JoVE.com

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

I denna metod odlas humana primära muskelceller in vitro för erhållande av differentierade myotubes och upptagningshastigheter för glukos mäts. Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för att kvantifiera frekvenserna i basala och insulinstimulerade tillstånd med radiomärkt [3H] 2-deoxi-D-glukos.

Uppmätt mätning av glukos och reaktion på insulinstimulering i<em&gt; In Vitro</em&gt; Odlade humana primära myotubes

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

The overall goal of this procedure is to measure the insulin stimulated glucose uptake in human primary muscle cells. This method can help answer the key questions in the muscle metabolism field, such as muscle cell insulin sensitivity. The main advantage of this technique is that it quantifies the effective muscle cell biological effect in response to hormonal stimulation.To begin the experiment, prepare proliferation medium, or PM, by supplementing Ham's F-10 medium with 2%fetal calf serum, or FCS, 2%serum substitute, 2 millimoles of glutamine, and 5 micrograms per milliliter of penicillin streptomycin. Prepare a differentiation medium, or DM, by supplementing Dulbecco's Modified Eagle Medium, or DMEM, with 2%FCS, 2 millimoles of glutamine, and 5 micrograms per milliliter of penicillin streptomycin. To prepare X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, or XDPBS, make a solution of DBPS containing 0.2%weight per volume bovine serum albumen.Filter the solution through a 0.2 micrometer filter. Then, store the XDPBS at 4 degrees Celsius. To prepare cold 2DG solution, weigh 16.4 milligrams of 2DG, insolubalize it in 10 milliliters of distilled water to obtain a 10 millimolar solution.Store the solution at 4 degrees Celsius. Next, add 600 microliters of cold 2DG and 6 microliters of radiolabeled 2DG to 5, 400 microliters of XDPBS to obtain the radiolabeled 2DG solution. Set aside a 20 microliter aliquot of radiolabeled 2DG solution.For the cytochalasin B mixture, add 2 microliters of 20 millimolar cytochalasin B to 2 milliliters of radiolabeled 2DG solution. For the DMSO mixture, add 4 microliters of DMSO to the remaining 4 milliliters of radiolabeled 2DG solution. Rapidly thaw frozen vials of human muscle satellite cells in pre-warmed water until only a small ice block remains in the vial.Next, pour the cells directly into a 50 milliliter plastic tube containing 10 milliliters of pre-warmed PM.Centrifuge the tube for five minutes at 500 times G.Then, discard the supernatant. Add 18 milliliters of pre-warmed PM to the cell pellet and gently re-suspend the cells. Distribute 3 milliliters in each well of a six-well plate.Incubate the cells at 37 degrees Celsius and 5%CO2 for 48 to 72 hours until cells reach 90%confluence. After 48 to 72 hours, remove the PM and replace it with 3 milliliters of pre-warmed DM per well. Incubate the cells in standard conditions.Replace the DM medium every two days. It is important that cultured muscle cells reach the fully differentiated state for optimal insulin response and differentiated cells will have a expression inverse weak or no insulin stimulation of the glucose uptake. Wash differentiated muscle cells twice with 2 milliliters of PBS.Then, remove the PBS carefully and incubate the cells in 3 milliliters of DM without FCS for serum depletion. Next, replace the media in all wells with 3 milliliters of DM without FCS. Add 100 nanomoles of insulin to wells five and six.Then, incubate the human myotube culture. After one hour of insulin stimulation, wash the wells twice with 1 milliliter of XDPBS. Add 1 milliliter of cytochalasin B mixture to wells one and two and 1 milliliter of DMSO mixture to wells three to six.Incubate for 15 minutes at 37 degrees Celsius and 5%CO2. At the end of the incubation, immediately place the plate on ice. Wash the cells twice with 1 milliliter of ice cold PBS.Lyse the cells in each well with 600 microliters of 50 millimolar sodium hydroxide. Incubate the cells on ice for five minutes and mix them gently with slow orbital rotation. Using a pipette, re-suspend and collect the cell lysate.Add 400 microliters of each cell lysate to a liquid scintillation counting vial. Prepare a negative control vial with 400 microliters of 50 millimolar sodium hydroxide and a positive control vial with 20 microliters of TC20. Next, add 4 milliliters of liquid scintillation solution to each vial.Close the cap and mix each vial thoroughly for one to two seconds. Insert each vial in a liquid scintillation counter and measure the radioactivity according to the manufacturer's instructions. Record counts per minute for each scintillation vial for 10 minutes.Optical microscope images taken on day three reveal that myoblasts reach confluence and are typically mononucleated. After the medium is changed and on day eight, differentiation is complete and myotubes are aligned and typically polynucleated. The glucose uptake rate was calculated in the control condition and the treatment condition.Insulin significantly increases glucose transport in the BSA condition. When the human myotube cell response to insulin is expressed as fold change, it is clear that the response to insulin decreased in myotubes treated with palmitate. After watching this video, you should have a good understanding of how to investigate insulin sensitivity in muscle cell through the determination of glucose uptake rates.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Cellular Processes

Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Bildproduktion av tät-core Blåsor i Primär Odlade hippocampus nervceller

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Kvantifiering av γH2AX Foci som svar på joniserande strålning

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Injektionsstället och Hemolymph Extraction till Mät insulinkänsligheten hos vuxna Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering av ribosom Bundna framväxande Polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; För att identifiera Translationell Paus webbplatser Längs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organell Transport i Odlade<em&gt; Drosophila</em&gt; Celler: S2 cellinje och primär nervceller.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulering av Cytoplasmatiska DNA Sensing Pathways<em&gt; In Vitro</em&gt; Och<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Mätning Glutation-inducerad Foder Response i Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Tysta<em&gt; BRCA2</em&gt; För att identifiera nya BRCA2 reglerade biologiska funktioner i odlade humana celler

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Kanalförbindelse kommunikationen mellan: En funktionell Biomarker att bedöma biverkningar av gifter och toxiner, och hälsoeffekterna av naturliga produkter

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Mätning av insulin- och sammandragningsstimulerat glukosupptag i isolerade och inkuberade mogna skelettmuskler från möss

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...