Name: personalized needles for microinjections in the rodent brain
Uploaded: 2018-01-24T12:30:00
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Este trabalho tem sido apoiado por uma subvenção da Comunidade Europeia [projecto FP7-pessoas-2011-IAPP 285827 (EPIXCHANGE)].

Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comité de ética da Universidade de Ferrara para a experimentação Animal e pelo Ministério da saúde italiano. A chegada (pesquisa Animal: Reporting em experimentos Vivo11) orientações foram seguidas.
1. preparação de agulhas de quartzo
<ol><li>Limpar e esterilizar os capilares de quartzo (ver Tabela de materiais), colocando-os por 5 min em água destilada, 5 min em 99% de etanol e 5 min e...

<ol>
	<li>Kirik, D., Rosenblad, C., Bj&#246;rklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+behavioral+and+neurodegenerative+changes+following+partial+lesions+of+the+nigrostriatal+dopamine+system+induced+by+intrastriatal+6-hydroxydopamine+in+the+rat.">Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat.</a> Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).</li><li>Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eltoprazine+prevents+levodopa-induced+dyskinesias+by+reducing+striatal+glutamate+and+direct+pathway+activity.">Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity.</a> Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).</li><li>Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+pay+attention:+attentional+performance+time-stamped+prefrontal+cholinergic+activation,+diurnality,+and+performance.">Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance.</a> J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).</li><li>Shoichet, M. S., Winn, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+delivery+to+the+central+nervous+system.">Cell delivery to the central nervous system.</a> Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).</li><li>Simonato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+gene+therapy+for+neurological+disorders.">Progress in gene therapy for neurological disorders.</a> Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).</li><li>Bj&#246;rklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-and+Long-Term+Consequences+of+Intracranial+Injections+of+the+Excitotoxin,+Quinolinic+Acid,+as+Evidenced+by+GFA+Immunohistochemistry+of+Astrocytes.">Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes.</a> Brain Res. 317, 267-277 (1986).</li><li>Paradiso, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+delivery+of+fibroblast+growth+factor-2+and+brain-derived+neurotrophic+factor+reduces+spontaneous+seizures+in+an+epilepsy+model.">Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).</li><li>Falcicchia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+Status+Epilepticus-Induced+BDNF+Expression+with+Herpes+Simplex+Virus+Type-1+Based+Amplicon+Vectors.">Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors.</a> PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).</li><li>Munoz, J. L., Coles, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz+micropipettes+for+intracellular+voltage+microelectrodes+and+ion-selective+microelectrodes.">Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes.</a> J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+research:+reporting+in+vivo+experiments:+the+ARRIVE+guidelines.">Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).</li><li>Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+cell+therapies+to+the+clinic:+characteristics+of+cell+suspensions+in+large-diameter+injection+cannulae.">Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae.</a> Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).</li></ol>

A técnica descrita neste artigo cumpre as necessidades descritas na introdução para otimizar alevinos que são executados para vários fins12. As agulhas descritas aqui reduzem o dano a um nível mínimo, essencialmente não-detectável; a variância com agulhas de vidro (que são propensas a dobrar), agulhas de quartzo são rígidas e certifique-se de um hit confiável da região cerebral desejado mesmo em profundas coordenadas. Além disso, o furo lateral garante entrega da s...

Microinjeções têm sido utilizadas por um longo tempo para a entrega de compostos farmacologicamente ativos de modular a atividade neuronal em áreas específicas do cérebro. Além disso, eles têm sido usados para injetar toxinas perto de populações neuronais particulares, para imitar neurodegenerativas eventos característicos de determinadas doenças, por exemplo 6-hidroxi-dopamina no sistema de dopamina nigrostriatal para imitar a doença de Parkinson 1 , 2 ou o saporin de IgG immunotoxin 192 a lesão do sistema colinérgico3. Mais recentemente, procedimentos de microinjeção tem sido usados para entregar enxertos de vetores ou células virais para terapia de gene ou célula cerebral experimental transtornos4,5.
O tipo clássico de agulhas utilizadas nestes estudos é feito de aço inoxidável. Apesar de fácil e prático de usar, agulhas de aço têm um número de problemas6: eles são relativamente grandes e podem danificar o tecido, com vazamento da barreira hemato - encefálica e ativação de astrócitos; Além disso, eles podem produzir dielétrico de tecido cerebral que entra a agulha, criando um obstáculo, ou até mesmo completamente evitando o fluxo da solução desejada. Mais recentemente, agulhas de vidro preparado ad hoc dos capilares foram introduzidas no usam7,8. Estas não causam ativação de danos nem astrocyte significativa de tecido, mas são relativamente flexíveis e podem dobrar quando introduzida em estruturas profundas, reduzindo a precisão da localização (observações pessoais).
Portanto, há uma necessidade de reduzir, tanto quanto a possíveis danos (especialmente ao realizar experimentos para curar danos) aumentando a precisão e reprodutibilidade (i.e., certifique-se de que toda solução é entregue e assegurar a localização correta). Além disso, seria desejável usar projetos diferentes da agulha para garantir uma distribuição ideal da solução injetada em áreas do cérebro com diferentes geometrias. Neste artigo, descrevemos um protocolo para preparar e usar agulhas de quartzo para alevinos do cérebro de roedor. Devido ao alto ponto de fusão, capilares de quartzo não podem ser puxados em um extrator convencional e, portanto, tem não sido usados no passado para gerar agulhas. Quartzo, no entanto, oferece algumas vantagens importantes sobre o vidro, em particular de alta rigidez e quebra resistência9. Por causa da sua rigidez, agulhas de quartzo são ideais para injeções em regiões do cérebro ventral. Por causa de sua alta resistência à quebra, eles podem ser modelados para incluir vários furos, obtendo projetos que possam revelar-se mais eficazes mesmo quando segmentando regiões do cérebro com geometrias complexas10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Quartz capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato, CA USA</td>
			<td>Q100-50-10</td>
			<td>Without filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette storage jar</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>E210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser microdissector</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, St&#376;tzerbach, Germany</td>
			<td>19138-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinfusion pump</td>
			<td>Univentor, Zejtun, Malta</td>
			<td>Model 864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual microinjection pump kit</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Item#: MMP-KIT</td>
			<td>Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Drill</td>
			<td>Proxxon</td>
			<td>28510 MicroMot 50/E</td>
			<td>Ball bearing drive shaft with variable speed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artficial Cerebral Spinal Fluid</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>26 G Blunt: 19138-U 
			30 G Bevel: 20757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td>LEICA RM212RT</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

personalized needles for microinjections in the rodent brain

Microinjeções têm sido utilizadas por um longo tempo para a entrega de drogas ou toxinas dentro de áreas específicas do cérebro e, mais recentemente, eles têm sido utilizados para entregar produtos de terapia genética ou célula. Infelizmente, as técnicas de microinjeção atual usar agulhas de aço ou vidro, que são de qualidade inferior por várias razões: em particular, agulhas de aço podem causar danos nos tecidos e agulhas de vidro podem dobrar quando abaixado profundamente no cérebro, ausente da região de destino. Neste artigo, descrevemos um protocolo para preparar e usar agulhas de quartzo que combinam um número de características úteis. Estas agulhas não produzir dano tecidual detectável e, sendo muito rígida, garantir a entrega confiável na região desejada cérebro mesmo quando usando coordenadas profundas. Além disso, é possível personalizar o design da agulha, fazendo vários furos do diâmetro desejado. Vários furos facilitam a injeção de grandes quantidades de solução dentro de uma área maior, Considerando que grandes buracos facilitam a injeção de células. Além disso, estas agulhas de quartzo podem ser limpos e reutilizadas, tal que o procedimento se torna rentável.

Comparamos os danos induzidos por microinjeção direta no hipocampo dorsal de rato e striatum usando uma agulha de quartzo (ponta de diâmetro externo 60 µM; buraco de lado um 20 µM de diâmetro e tipo C, Figura 1), em comparação com dois clássico, fim brusco 26 G e borda chanfrada de 30 G agulhas de aço inoxidável. Para este objectivo, injetamos 2 µ l de aCSF na direita e deixou o hipocampo dorsal e striatum usando respectivamente o quartzo e a agul...

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Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Descrevemos aqui um protocolo para o microinjection do cérebro de roedores que usa agulhas de quartzo. Estas agulhas não produzir dano tecidual detectável e assegurar a entrega confiável, mesmo em regiões profundas. Além disso, eles podem ser adaptados às necessidades de pesquisa pelos projetos personalizados e podem ser reutilizados.

Agulhas personalizadas para alevinos do cérebro de roedor

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

FMRI simultânea e Eletrofisiologia no cérebro de roedores

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Neurociência

Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

Segmentação de estruturas cerebrais profundas com Microinjeções para entrega de drogas, vetores virais, ou Transplantes de Células

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an ...

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

A descrição visual do Dissecção da vasculatura cerebral Superfície e Meninges Associados e plexo coróide do cérebro de um rato

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Crescer a partir de células-tronco neurais convencionais e não convencionais Regiões do cérebro adulto de roedores

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Gravação de plasticidade sináptica em fatias Hippocampal agudas, mantidas em um pequeno volume reciclagem - perfusão- e sistema de câmara de submersão-tipo

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Avaliação da densidade de sinapse em fatias Hippocampal cérebro de roedor

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Efeitos de Neurotrauma induzida por explosão em roedores pressurizado artérias cerebrais de médio

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

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Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Usando a fluorescência near-infrared e a exploração de alta resolução para medir a expressão da proteína no cérebro do roedor

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