Name: transient expression and cellular localization of recombinant proteins in cultured insect cells
Uploaded: 2017-04-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells at JoVE.com

Vi tackar Lynn Forlow-Jech och Dannialle LeRoy för tekniskt stöd. Detta arbete stöddes av bas CRIS finansiering USDA ARS, nationella programmet 304 - Crop Protection och karantän [Project # 2020-22620-022-00D] till JAF och JJH Omnämnandet av firmanamn eller kommersiella produkter i denna artikel är endast i syfte att ge specifik information och innebär inte någon rekommendation från US Department of Agriculture. USDA är en lika möjligheter leverantör och arbetsgivare.

1. OE-PCR för konstruktion av expressionsplasmider Obs: Se tabell 1 för alla primers som används i OE-PCR. Användningen av en high-fidelity DNA-polymeras rekommenderas för alla förstärkningar. Men eftersom dessa enzymer ofta inte lämnar en 3&#39; A, är det nödvändigt att utföra en kort, icke-amplifiera inkubation med ett Taq-DNA-polymeras för att &#39;A-svans&#39; av PCR-produkter före kloning in dem i en TA insektscelluttryck vektor. Detta protokoll visar en met...

<ol>
	<li>Kost, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).</li><li>van Oers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+baculovirus-insect+cell+protein+expression:+from+dark+horse+to+mainstream+technology.">Thirty years of baculovirus-insect cell protein expression: from dark horse to mainstream technology.</a> J. Gen. Virol. 96 (1), 6-23 (2015).</li><li>Contreras-G&#242;mez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+using+the+baculovirus-insect+cell+expression+system.">Protein production using the baculovirus-insect cell expression system.</a> Biotechnol. Progr. 30 (1), 1-18 (2014).</li><li>Hunt, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gene+to+protein:+a+review+of+new+and+enabling+technologies+for+multi-parallel+protein+expression.">From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression.</a> Protein Expres. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).</li><li>Kollewe, C., Vilcinskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+in+insect+cells.">Production of recombinant proteins in insect cells.</a> Am. J. Biochem. Biotechnol. 9 (3), 255-271 (2013).</li><li>Altmann, F., Berger, E. G., Clausen, H., Cummings, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+cells+as+hosts+for+the+expression+of+recombinant+glycoproteins.">Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins.</a> Glycotechnology. , 29-43 (1999).</li><li>Shen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+plasmid-based+transient+gene+expression+method+using+High+Five+cells.">A simple plasmid-based transient gene expression method using High Five cells.</a> J. Biotechnol. 216, 67-75 (2015).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+screening+of+membrane+protein+expression+in+transiently+transfected+insect+cells.">Rapid screening of membrane protein expression in transiently transfected insect cells.</a> Protein Expres. Purif. 88 (1), 134-142 (2013).</li><li>Shen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-free+transient+protein+production+in+Sf9+cells.">Virus-free transient protein production in Sf9 cells.</a> J. Biotechnol. 171, 61-70 (2014).</li><li>Loomis, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=InsectDirect+System:+rapid,+high-level+protein+expression+and+purification+from+insect+cells.">InsectDirect System: rapid, high-level protein expression and purification from insect cells.</a> J. Struct. Funct. Genomics. 6 (2), 189-194 (2005).</li><li>Wurch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+overlap+extension+PCR+method+to+create+chimeric+genes+in+the+absence+of+restriction+enzymes.">A modified overlap extension PCR method to create chimeric genes in the absence of restriction enzymes.</a> Biotechnol. Tech. 12 (9), 653-657 (1998).</li><li>Woodman, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+PCR+of+intact+bacteria+(colony+PCR).">Direct PCR of intact bacteria (colony PCR).</a> Curr. Protoc. Microbiol. 9 (3), 1-6 (2008).</li><li>Mathew, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+functional+aquaporin+water+channel+protein+from+alimentary+tract+of+whitefly,+Bemisia+tabaci.">Identification and characterization of functional aquaporin water channel protein from alimentary tract of whitefly, Bemisia tabaci.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 178-190 (2011).</li><li>Van Ekert, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+functional+characterization+of+Bemisia+tabaci+aquaporins+reveals+the+water+channel+diversity+of+hemipteran+insects.">Molecular and functional characterization of Bemisia tabaci aquaporins reveals the water channel diversity of hemipteran insects.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 39-51 (2016).</li><li>Hull, J. J., Brent, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+sex+peptide+receptor-like+transcript+from+the+western+tarnished+plant+bug+Lygus+hesperus.">Identification and characterization of a sex peptide receptor-like transcript from the western tarnished plant bug Lygus hesperus.</a> Insect Mol. Biol. 23 (3), 301-319 (2014).</li><li>Maroniche, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+set+of+Gateway-compatible+vectors+for+live+imaging+in+insect+cells.">Development of a novel set of Gateway-compatible vectors for live imaging in insect cells.</a> Insect Mol. Biol. 20 (5), 675-685 (2011).</li><li>Hull, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+western+tarnished+plant+but+(Lygus+hesperus)+olfactory+co-receptor+ORCO:+Expression+profile+and+confirmation+of+atypical+membrane+topology.">Identification of the western tarnished plant but (Lygus hesperus) olfactory co-receptor ORCO: Expression profile and confirmation of atypical membrane topology.</a> Arch. Insect Biochem. 81 (4), 179-198 (2012).</li><li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+the+PBAN+receptor+molecule:+Characterization+of+PBANR+variants+expressed+in+the+pheromone+glands+of+moths.">Re-evaluation of the PBAN receptor molecule: Characterization of PBANR variants expressed in the pheromone glands of moths.</a> Front. Endocrinol. 3 (6), 1-12 (2012).</li><li>Fabrick, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+functional+characterization+of+multiple+aquaporin+water+channel+proteins+from+the+western+tarnished+plant+bug,+Lygus+hesperus.">Molecular and functional characterization of multiple aquaporin water channel proteins from the western tarnished plant bug, Lygus hesperus.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 45, 125-140 (2014).</li><li>Lu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+baculovirus+(Bombyx+mori+nuclear+polyhedrosis+virus)+repeat+element+functions+as+a+powerful+constitutive+enhancer+in+transfected+insect+cells.">A baculovirus (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) repeat element functions as a powerful constitutive enhancer in transfected insect cells.</a> J. Biol. Chem. 272, 30724-30728 (1997).</li><li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+activity+of+two+promoters+in+insect+cells.">Comparative analysis of the activity of two promoters in insect cells.</a> African J. Biotechnol. 10, 8930-8941 (2011).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).</li><li>Kohnhorst, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+functions+of+proteins+under+fluorescence+single-cell+microscopy.">Subcellular functions of proteins under fluorescence single-cell microscopy.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1864, 77-84 (2016).</li><li>Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+quantitative+colocalization+analysis:+focus+on+neuroscience.">Recent advances in quantitative colocalization analysis: focus on neuroscience.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Chalfie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotech. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li></ol>

Heterologa proteinexpressionssystem är viktiga verktyg för produktion av rekombinanta proteiner som används i talrika nedströms tillämpningar 4. Att välja från de olika uttryckssystem tillgängliga beror på slutmålet för proteinet av intresse. Flera insektscellexpressionssystem finns tillgängliga som erbjuder flexibla alternativ till prokaryota och eukaryota celler expressionssystem 5, 6. Insekts system som kräver bakulovirusi...

Produktionen av rekombinanta proteiner med hjälp av insektscellexpressionssystem erbjuder många fördelar för studier av eukaryota proteiner. Nämligen, insektsceller har liknande posttranslationella modifieringar, bearbetning, och sorteringsmekanismer som de som förekommer i däggdjursceller, vilket är fördelaktigt för framställning av korrekt veckade proteiner 1, 2, 3. Insektcellsystem kan ofta också kräver mindre resurser och mindre tid och ansträngning för underhåll än däggdjurscellinjer 4, 5. Baculovirusexpressionssystemet är ett sådant insektscellbaserat system som nu används i stor utsträckning i många discipliner, inklusive produktion av rekombinanta proteiner för proteinkarakterisering och terapeutika, den immunogena presentation av främmande peptider och virala proteiner för vaccinproduktion, syntesen av multi Protein komplex, Produktion av glykosylerade proteiner, osv. 1, 2, 4, 6. Det finns dock situationer där baculovirus-expressions kanske inte är tillämplig 3, 7, och användningen av icke-lytisk och transienta insektsexpressionssystem kan vara mer lämpligt. Specifikt, erbjuder transient insektscelluttryck möjligheten för snabb syntes av rekombinant protein, kräver mindre utveckling och underhåll, inte involverar virala pålagda cellys, och tillhandahåller ett medel för att bättre studera cellulärt trafficking under proteinsyntes 7, 8, 9, 10. Detta protokoll beskriver den snabba alstringen av expressionsvektorer med användning av två steg överlappande extensions-PCR (OE-PCR) Escherichia coli. Plasmider används för att dubbel transfektera kommersiellt tillgängliga odlade insektsceller och för att framställa representativa proteiner. Protokollet beskriver produktionen och användningen av två olika fluorescensmärkta subcellulära markörproteiner och visar samlokalisering med två aquaporin proteiner från insekten Bemisia tabaci. Följande protokoll tillhandahåller den grundläggande metodiken för OE-PCR, insektscellunderhåll och transfektion och fluorescensmikroskopi för den cellulära lokaliseringen av målproteiner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1353">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:425px;">KOD DNA Polymerase</td>
			<td style="width:164px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">71085-3</td>
			<td style="width:645px;">High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:425px;">ExTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:164px;">TaKaRa-Clontech</td>
			<td style="width:119px;">RR001B</td>
			<td>DNA polymerase used for A-tailing of PCR products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:425px;">EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix</td>
			<td style="width:164px;">Lucigen</td>
			<td style="width:119px;">30033-1</td>
			<td>DNA polymerase used for bacterial colony PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:425px;">Biometra TProfessional Gradient Thermocycler</td>
			<td style="width:164px;">Biometra/LABRepCo</td>
			<td style="width:119px;">070-851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:425px;">Agarose LE</td>
			<td style="width:164px;">Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A1705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:425px;">SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:425px;">Montage DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:164px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">LSKGEL050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:425px;">pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">K89020</td>
			<td style="width:645px;">Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:425px;">QIAprep Spin MiniPrep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:425px;">QIAcube Robotic Workstation</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">9001292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purifier Vertical Clean Bench</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>3970401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tni cultured insect cell Line</td>
			<td>Allele Biotech</td>
			<td>ABP-CEL-10005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sf9 cultured insect cell Line</td>
			<td>Allele Biotech</td>
			<td>ABP-CEL-10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serum-Free Insect Culture Medium</td>
			<td>Allele Biotech</td>
			<td>ABP-MED-10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TNM-FH Insect Culture Medium</td>
			<td>Allele Biotech</td>
			<td>ABP-MED-10001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPL-41 Insect Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11405081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cellfectin II Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10362100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16 cm Disposable Cell Scrapers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1832</td>
			<td>Cell scrapers with two-position blade</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps</td>
			<td>Life Science Products</td>
			<td>CT-229331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1371120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes</td>
			<td>Life Science Products</td>
			<td>CT-229475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PipetteBoy</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14222-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mL Serological Pipettes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1253.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14230200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polypropylene Biohazard Autoclave Bags</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01828C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes</td>
			<td>Matsunami Glass</td>
			<td>D35-14-1.5-U</td>
			<td>35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator, Model 1510E</td>
			<td>VWR</td>
			<td>35823-961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Countess II FL Cell Counter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV10i-LIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HsPLA2/pCS6 plasmid DNA</td>
			<td>transOMIC Technologies</td>
			<td>TCH1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pmCherry Vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:425px;">NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)</td>
			<td style="width:164px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient expression and cellular localization of recombinant proteins in cultured insect cells

Heterologa proteinexpressionssystem används för produktion av rekombinanta proteiner, tolkningen av cellulära trafficking / lokalisering, och bestämningen av den biokemiska funktionen hos proteiner på sub-organismnivå. Även baculovirus expressionssystem används alltmer för proteinproduktion i många biotekniska, läkemedels- och industriella tillämpningar, icke-lytisk system som inte involverar virusinfektion har klara fördelar, men är ofta förbisedd och underutnyttjade. Här beskriver vi en metod för att generera icke-lytisk expressionsvektorer och transient uttryck av rekombinant protein. Detta protokoll möjliggör effektiv cellulära lokaliseringen av rekombinanta proteiner och kan användas för att snabbt urskilja protein trafficking inom cellen. Vi visar uttrycket av fyra rekombinanta proteiner i en kommersiellt tillgänglig insektscellinje, däribland två aquaporin proteiner från insekten Bemisia tabaci, samtsom subcellulära markörproteiner som är specifika för cellplasmamembranet och för intracellulära lysosomer. Alla rekombinanta proteiner producerades som chimärer med fluorescerande proteinmarkörer vid deras karboxyl-termini, vilket möjliggör direkt detektion av de rekombinanta proteinerna. Den dubbla transfektion av celler med plasmider som härbärgerar konstruktioner för generna av intresse och en känd subcellulär markör möjliggör levande cell imaging och förbättrad validering av cellulär proteinlokalisering.

OE-PCR OE-PCR medger syntes av chimära DNA-produkter som, när insatt i en expressionsvektor, möjliggör produktion av rekombinanta chimära proteiner som motsvarar något test genen av intresse och fluorescerande markörprotein. Figur 1 representerar ett allmänt schema för framställning av PIB expressionsvektorer innehållande B. tabaci aquaporin kodande sekvenser (BtDrip1 och BtDrip2_v1) i-ram med...

Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells at JoVE.com

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Icke-lytisk insektscellexpressionssystem är underutnyttjade för tillverkning, cellulär trafficking / lokalisering, och rekombinant protein funktionell analys. Här beskriver vi metoder för att generera expressionsvektorer och efterföljande övergående proteinuttryck i kommersiellt tillgängliga ordningen fjärilar cellinjer. Co-lokalisering av Bemisia tabaci aquaporiner med subcellulära fluorescerande markörproteiner presenteras också.

Transient expression och cellulär lokalisering av rekombinanta proteiner i odlade insektsceller

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

En metod för produktion av rekombinanta mCD1d Protein i insektsceller.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expression av rekombinanta proteiner i Methylotrophic Jäst Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Effektiv Agroinfiltration av växter för hög nivå Transient Expression av rekombinanta proteiner

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Effektiv Produktion och rening av rekombinant Murina Kindlin-3 från insektsceller för biofysikalisk Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Hög genomströmning Kvantitativ Expression Screening och rening Tillämpat på rekombinant Disulfide rika Venom proteiner som produceras i<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Transient Expression av proteiner från Hydrodynamisk Gene Delivery hos möss

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening för att identifiera Ubiquitin och Ubiquitin-liknande system Regulatorer av biologiska banor i odlade däggdjursceller

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

En jämförande analys av rekombinant proteinuttryck i olika Biofactories: Bakterier, insektsceller och växt Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...