Name: analysis of protein-protein interactions and co-localization between components of gap, tight, and adherens junctions in murine mammary glands
Uploaded: 2017-05-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands at JoVE.com

IPは、カナダ自然科学・工学研究協議会（NSERC＃418233-2012）の資金提供を受けています。ケベック・サンテ（FRQS）、ケベック乳がん財団のキャリア賞、カナダ財団のイノベーション・グラントのリーダー・ファンド・グラントなどがあります。 EDはFondationの大学のArmand-Frappierから奨学金を受けました。

この研究で使用された全ての動物プロトコールは、University Animal Care Committee（INRS-Institut Armand-Frappier、Laval、Canada）によって承認された。 1.タンパク質共局在の同定<ol><li> 組織から顕微鏡スライドまで 注記：組織や切片はドライアイスで取り扱う必要があります。 <ol><li>動物から乳腺を摘出する（この手順の完全な説明については、Plante らを参?...

<ol>
	<li>Sternlicht, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+stages+in+mammary+gland+development:+the+cues+that+regulate+ductal+branching+morphogenesis.">Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis.</a> Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).</li><li>Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alveolar+switch:+coordinating+the+proliferative+cues+and+cell+fate+decisions+that+drive+the+formation+of+lobuloalveoli+from+ductal+epithelium.">The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium.</a> Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).</li><li>Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alveolar+switch:+coordinating+the+proliferative+cues+and+cell+fate+decisions+that+drive+the+formation+of+lobuloalveoli+from+ductal+epithelium.">The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium.</a> Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).</li><li>El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+gap+junctions+and+their+role+in+mammary+epithelial+cell+differentiation.">Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8 (4), 463-473 (2003).</li><li>Hennighausen, L., Robinson, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Information+networks+in+the+mammary+gland.">Information networks in the mammary gland.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (9), 715-725 (2005).</li><li>Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoepithelial+cells:+their+origin+and+function+in+breast+morphogenesis+and+neoplasia.">Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).</li><li>Nguyen, D. A., Neville, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+regulation+in+the+mammary+gland.">Tight junction regulation in the mammary gland.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3 (3), 233-246 (1998).</li><li>Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+role+of+connexins+in+mammary+gland+morphogenesis+and+function.">Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function.</a> Reproduction. 149 (6), R279-R290 (2015).</li><li>Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+and+beta-catenin+transiently+form+junctional+nexuses+during+the+post-natal+mammary+gland+development.">Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development.</a> Dev Biol. 416 (1), 52-68 (2016).</li><li>Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+influence+of+connexins+and+apical+junction+proteins+on+their+expressions+and+functions.">Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions.</a> Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 768-778 (2009).</li><li>Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+intracellular+movement+of+connexins+by+E-cadherin+in+murine+skin+papilloma+cells.">Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells.</a> Exp Cell Res. 270 (2), 235-247 (2001).</li><li>Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+(Forster)+resonance+energy+transfer+imaging+of+oncogene+activity+in+living+cells.">Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells.</a> Cancer Sci. 97 (1), 8-15 (2006).</li><li>Gustafsdottir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays+for+sensitive+and+specific+protein+analyses.">Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses.</a> Anal Biochem. 345 (1), 2-9 (2005).</li><li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+mammary+gland+development+and+function+in+mouse+models.">Evaluation of mammary gland development and function in mouse models.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).</li><li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+methodology+for+reliable+quantification+of+Western+blot+data.">A defined methodology for reliable quantification of Western blot data.</a> Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).</li><li>Oxford, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+composition+of+the+intercalated+disc+in+a+spontaneous+canine+animal+model+of+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia/cardiomyopathy.">Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy.</a> Heart Rhythm. 4 (9), 1196-1205 (2007).</li><li>Wang, X., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+mislocalization:+mechanisms,+functions+and+clinical+applications+in+cancer.">Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer.</a> Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 13-25 (2014).</li><li>Bertocchi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+architecture+of+cadherin-based+cell+adhesions.">Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions.</a> Nat Cell Biol. 19 (1), 28-37 (2017).</li><li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Fluorescent+Protein+FRET+Pairs.">A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs.</a> Sensors (Basel). 16 (9), (2016).</li><li>Fredriksson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+proteins+surrounding+occludin+and+claudin-4+reveals+their+proximity+to+signaling+and+trafficking+networks.">Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks.</a> PLoS One. 10 (3), e0117074 (2015).</li><li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays:+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox.">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).</li><li>Malovannaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+analysis+schema+for+high-throughput+identification+of+endogenous+protein+complexes.">Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).</li></ol>

接合部を介する細胞間相互作用は、乳腺などの多くの器官の適切な機能および発達のために必要とされる。研究により、接合タンパク質は相互の機能および安定性を調節し、細胞膜10にお互いをつなぎ合わせることによってシグナル伝達を活性化することが示されている。現在の原稿で提示されたプロトコールは、正常なマウス腺の発生中のジャンクショナルタンパク質の?...

乳腺の成長と発達は、主に出生後に起こる。この臓器は、哺乳動物の生殖生涯を通して常にそれ自体を改造する1 。成体乳腺上皮は内腔上皮細胞の内層と基底細胞の外層（主に筋上皮細胞から構成され、基底膜2で囲まれている）からなる。乳腺の構造と発達に関する良いレビューのために、読者はSternlicht 1を参照することができます。腺1、3、4、5、6の正常な発達および機能のためには、ギャップ（GJ）、タイト（TJ）およびアフェレン（AJ）ジャンクションを介した細胞 - 細胞相互作用が必要である。マウス乳腺におけるこれらの接合部の主成分は、Cx26、Cx30、Cx32、およびCx43（GJ）である。 Claudin-1、-3、-4、-7およびZO-1（TJ）; E-カドヘリン、P-カドヘリンおよびβ-カテニン（AJ） 7,8 。これらの異なる接合タンパク質の発現レベルは、乳腺発達中に段階依存的に変化し、異なる細胞 - 細胞相互作用要件を示唆している9 。 GJ、TJ、およびAJは、構造的および機能的に連結され、隣接する細胞の隣接する部位に他の構造または調節タンパク質をつなぎ合わせることにより、接合的連結体10を生成する。結合接合の組成は、根底にある細胞骨格との架橋、ならびにネクサスの透過性および安定性に影響を及ぼし得、その結果、腺8,9,10,11の機能に影響を及ぼし得る。接合部接合部に存在するか、または相互に相互作用する細胞間接合部の成分は、乳がん発達の最近の発達段階を、共免疫蛍光（co-IF）および同時免疫沈降（co-IP） 9を用いて最近解析した。他の技術はタンパク質間の機能的関連性の評価を可能にするが、これらの方法はこの原稿には示されていない。 タンパク質は機能するだけで単独で作用するため、シグナル伝達や生化学カスケードなどのタンパク質 - タンパク質相互作用（PPI）の研究は多くの研究者にとって不可欠であり、タンパク質の機能に関する重要な情報を提供することができます。 Co-IFおよび顕微鏡分析は、同じ細胞下の空間を共有するいくつかのタンパク質を評価するのに役立ちます。しかしながら、標的の数は、異なる動物において惹起されなければならない抗体によって、および異なる波長レーザーを備える共焦点顕微鏡および多重化のためのスペクトル検出器にアクセスすることによって制限される。 Co-IPは、親和性の高い物理的相互作用を確認または明らかにするタンパク質複合体内に存在する2つ以上のタンパク質を含む。タンパク質の局在化および相互作用を同時に検出することができる蛍光共鳴エネルギー移動（FRET） 12および近接ライゲーションアッセイ（PLA） 13などの新規技術の開発にもかかわらず、co-IPは、間の相互作用を研究するための適切かつ手頃な技術である内在性タンパク質。 この原稿で説明されている段階的方法は、乳腺の内在性PPIを研究する際に避けるために、タンパク質の局在化およびPPIの研究を容易にし、落とし穴を指摘するでしょう。この方法論は、各技術に必要な組織の異なる保存手順の提示から始まる。第1部では、i）乳腺の切片化、ii）co-IF法を用いた異なるタンパク質の二重標識または三重標識、およびiii）タンパク質の局在化。パート2は、内因性タンパク質を沈降させ、その相互作用タンパク質をi）溶解産物調製、ii）間接タンパク質免疫沈降、およびiii）SDS-PAGEおよびウェスタンブロットによる結合パートナー同定の3つのステップで同定する方法を示す。このプロトコールの各ステップは、げっ歯類の乳腺組織に対して最適化され、高品質で特異的かつ再現性のある結果を生じる。このプロトコールは、他の組織または細胞系におけるPPI研究の出発点として使用することもできる。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice strain and stage&#160;</td>
			<td>St. Constant, Quebec, Canada</td>
			<td></td>
			<td>C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X (stock)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Dissolve 80g NaCl (F.W.: 58.44), 2g KCl (F.W. 74.55), 26.8g Na2HPO4&#8226;7H2O (F.W. 268.07) and 2.4g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800ml distilled water.&#160; 
			2)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Adjust the PH to 7.4&#160; 
			3)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Add water to reach to the 1 litre final volume.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS 10X (stock)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Dissolve 60.5g TRIS, 87.6g NaCl in 800ml distilled water.&#160; 
			2)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Adjust the PH to 7.5&#160; 
			3)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Add water to reach to the 1 litre final volume.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Part 1-Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing media</td>
			<td>VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada</td>
			<td>95067-840</td>
			<td>VMR frozen sections compound&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>956640</td>
			<td>Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115V 60Hz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>C.L. Sturkey, Inc. Les Produits&#160;Scientifiques&#160;ESBE&#160;St-Laurent, QC, Canada</td>
			<td>&#160;BLM1001C</td>
			<td>High profile gold coated blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td>Cedarlane, Burlington, ON, Canada</td>
			<td>8899</td>
			<td>Super PAP Pen, Thermo fisher scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic slides</td>
			<td>Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Fisherbrand&#160;Superfrost Plus Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada</td>
			<td>FOR201.1</td>
			<td>Forlmadehyde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3% BSA in TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TBS-Tween 20 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Oakville, ON, Canada</td>
			<td>P 9416</td>
			<td>Tween 20, Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Cedarlane, Burlington, ON</td>
			<td>17984-25(EM)</td>
			<td>Fluoromount-G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First &#38; secondary antibodies&#160;</td>
			<td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td>
			<td>Mentioned in Column D</td>
			<td>E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First &#38; secondary antibodies&#160;</td>
			<td>Life technologies, Waltham, MA, USA &#38; Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td>
			<td>Mentioned in Column D</td>
			<td>Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First &#38; secondary antibodies&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada&#160;</td>
			<td>Mentioned in Column D</td>
			<td>&#946;-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First &#38; secondary antibodies&#160;</td>
			<td>Life technologies, Waltham, MA, USA &#38; Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td>
			<td>Mentioned in Column D</td>
			<td>Connexin26&#160; (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei stain</td>
			<td>Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada</td>
			<td>D1306</td>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1000 in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon Canada, Mississauga, On, Canada</td>
			<td></td>
			<td>Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software of IF images analysis</td>
			<td>Nikon Canada, Mississauga, On, Canada</td>
			<td></td>
			<td>NIS-elements software (version 4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Part 2-Immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple-detergent Lysis buffer (100ml) pH=8.0&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1) Mix 50mM TRIS (F.W.&#160;:121.14), 150mM NaCl (F.W.&#160;:58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80ml distilled H2O.&#160; 
			2) Adjust the PH to 8.0 with HCl 6N (~0.5ml). 
			3) Adjust the volume to 100ml. Keep it in fridge.&#160; 
			At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: 
			Sodium Fluorid (stock) solution 1.25M (F.W. 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1M (F.W.: 183.9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease/phosphatase inhibitor</td>
			<td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td>
			<td>78441</td>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein dosage</td>
			<td>Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA</td>
			<td>23225</td>
			<td>Pierce BCA protein assay kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinder</td>
			<td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td>
			<td>FTH-115</td>
			<td>Power 125, Model FTH-115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic beads and stand</td>
			<td>Millipore, Etobicoke, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td>PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash solution for IP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies for immunoprecipitation</td>
			<td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td>
			<td>Mentioned in coulmn D</td>
			<td>IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 &#181;l/200 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies for immunoprecipitation</td>
			<td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td>
			<td>Mentioned in coulmn D</td>
			<td>IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 &#181;l/200 &#181;l&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies for immunoprecipitation</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada</td>
			<td>Mentioned in coulmn D</td>
			<td>Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 &#181;l/200 &#181;l&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies for immunoprecipitation</td>
			<td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td>
			<td>Mentioned in coulmn D</td>
			<td>E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 &#181;l/200 &#181;l&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli buffer&#160;</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada</td>
			<td>1610747</td>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer (Add &#946;-mercaptoethanol following manufacturer recommendation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic glycine&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td>
			<td>PB381-5</td>
			<td>0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>1 M (pH=8)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE acrylamide gels&#160;</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>1610180 -5</td>
			<td>TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Running buffer 10x&#160;</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>1704272</td>
			<td>Tris 30.3g/glycine 144.1g /SDS 10g in 1 litre distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membranes</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>1704272</td>
			<td>PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer method</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>1704155</td>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Milk</td>
			<td>Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td>Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution for blots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing solutions for blots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TBS-Tween 20 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary and secondary antibodies for blots (10ml)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario &#38; Abcam, Toronto, ON, Canada</td>
			<td>Mentioned in column D</td>
			<td>Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary and secondary antibodies for blots (10ml)</td>
			<td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA &#38; Abcam, Toronto, ON, Canada</td>
			<td>Mentioned in column D</td>
			<td>E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody&#160; (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary and secondary antibodies for blots (10ml)</td>
			<td>Life technologies, Waltham, MA, USA &#38; Abcam, Toronto, ON, Canada</td>
			<td>Mentioned in column D</td>
			<td>Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366)&#160; 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary and secondary antibodies for blots (10ml)</td>
			<td>Life technologies, Waltham, MA, USA &#38; Abcam, Toronto, ON, Canada</td>
			<td>Mentioned in column D</td>
			<td>Claudin3&#160; (#34-1700) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody&#160; (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol solution for signal detection on blots</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>1705061&#160;</td>
			<td>Clarity Western ECL Blotting Substrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging blots</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>1708280</td>
			<td>ChemiDoc MP imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analayzing blots</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td>ImageLab 5.2 software&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of protein-protein interactions and co-localization between components of gap, tight, and adherens junctions in murine mammary glands

細胞 - 細胞相互作用は、組織の完全性および乳腺の異なる区画間の障壁を保存する中枢的役割を果たす。これらの相互作用は、隣接する細胞間の連結を形成する結合タンパク質によって提供される。接合タンパク質の位置の誤った局在化およびそれらの結合パートナーとの物理的関連の低下は、機能の喪失をもたらし、その結果、器官の機能不全をもたらし得る。したがって、正常および疾患関連組織におけるタンパク質局在化およびタンパク質 - タンパク質相互作用（PPI）の同定は、発症状態の疾患または変化の進行につながる新しい証拠およびメカニズムを見出すために不可欠である。この原稿は、マウス乳腺におけるPPIを評価するための2段階の方法を提示している。プロトコルセクション1では、目的のタンパク質に対して生じた抗体、続いて蛍光色素で標識された二次抗体を用いて共免疫蛍光（co-IF）を行う方法が記載されている。 co-IF allタンパク質の接近を実証するために、物理的な相互作用を研究することが可能です。したがって、共免疫沈降（co-IP）のための詳細なプロトコールがプロトコールセクション2に提供される。この方法は、これらの相互作用が直接的であるか間接的であるかを確認することなく、タンパク質間の物理的相互作用を決定するために使用される。ここ数年、co-IFおよびco-IP技術は、細胞間接合のある種の成分が共に局在化し、相互作用し、乳腺発達中に変化する段階依存的接合結合を生じることを実証している。

GJ、AJ、およびTJ成分が乳腺で相互作用できるかどうかを判定するために、最初にco-IFアッセイを行った。 GJタンパク質であるCJ26とAJタンパク質であるβ-カテニンを特異的抗体でプローブし、それぞれフルオロフォア接合マウス647（緑色、疑似色）およびヤギ568（赤色）抗体を用いて明らかにした（ 図1BおよびC ） 。データは、泌乳日7日目（L7...

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Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

細胞間接合部は、乳腺段階特異的機能および発達のための必要条件である。この写本は、タンパク質 - タンパク質相互作用（PPI）の研究およびマウス乳腺を用いた共局在のための詳細なプロトコールを提供する。これらの技術は、異なる発達段階での細胞間接合間の物理的関連の動態の調査を可能にする。

マウス乳腺のギャップ、タイトおよびアデュランス接合部の成分間のタンパク質 - タンパク質相互作用および共局在の分析

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

で活躍ERKの時空間解析<em&gt; C。エレガンス</em&gt;生殖細胞系列

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

細胞系譜マーカーの共局在とトマト信号

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

薬物治療と<em&gt;インビボ</em&gt;メダカ骨粗鬆症モデルにおける骨芽細胞破骨細胞の相互作用のイメージング

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

の胚性血管新生の可視化と定量分析<em&gt;ツメガエル</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

細胞外小胞/エキソソームを介した乳腺上皮細胞と乳房管腔細胞との間の乳腺形成能の伝達

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method

ショール分析法を用いたラット乳腺全身の分枝密度の定量

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

血管内皮幹細胞の血管形成を視覚化するための新規乳腺脂肪移植技術

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

ゼブラフィッシュの網膜におけるタンパク質局在を解決する相関超解像および電子顕微鏡観察

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...