Name: analysis of protein-protein interactions and co-localization between components of gap, tight, and adherens junctions in murine mammary glands
Uploaded: 2017-05-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands at JoVE.com

IP는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 협의회 (NSERC # 418233-2012)의 지원을받습니다. Frans de Recherche du Québec-Santé (FRQS), Quebec Breast Cancer Foundation 경력 상 및 캐나다 재단 혁신 재단 (Canadian Foundation for Innovation)으로부터 Leader Founds 보조금을 받았다. ED는 Fondation 유니버설 Armand-Frappier에서 장학금을 받았습니다.

이 연구에서 사용 된 모든 동물 프로토콜은 University Animal Care Committee (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canada)의 승인을 받았습니다. 1. 단백질 공 동화 확인 <ol><li> 조직에서 현미경 슬라이드까지 참고 : 조직 및 섹션은 드라이 아이스로 처리해야합니다. <ol><li> 동물에서 유선을 절단하십시오 (이 절차에 대한 완전한 설명은 Plante et al. 참조 )</...

<ol>
	<li>Sternlicht, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+stages+in+mammary+gland+development:+the+cues+that+regulate+ductal+branching+morphogenesis.">Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis.</a> Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).</li><li>Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alveolar+switch:+coordinating+the+proliferative+cues+and+cell+fate+decisions+that+drive+the+formation+of+lobuloalveoli+from+ductal+epithelium.">The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium.</a> Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).</li><li>Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alveolar+switch:+coordinating+the+proliferative+cues+and+cell+fate+decisions+that+drive+the+formation+of+lobuloalveoli+from+ductal+epithelium.">The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium.</a> Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).</li><li>El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+gap+junctions+and+their+role+in+mammary+epithelial+cell+differentiation.">Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8 (4), 463-473 (2003).</li><li>Hennighausen, L., Robinson, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Information+networks+in+the+mammary+gland.">Information networks in the mammary gland.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (9), 715-725 (2005).</li><li>Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoepithelial+cells:+their+origin+and+function+in+breast+morphogenesis+and+neoplasia.">Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).</li><li>Nguyen, D. A., Neville, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+regulation+in+the+mammary+gland.">Tight junction regulation in the mammary gland.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3 (3), 233-246 (1998).</li><li>Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+role+of+connexins+in+mammary+gland+morphogenesis+and+function.">Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function.</a> Reproduction. 149 (6), R279-R290 (2015).</li><li>Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+and+beta-catenin+transiently+form+junctional+nexuses+during+the+post-natal+mammary+gland+development.">Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development.</a> Dev Biol. 416 (1), 52-68 (2016).</li><li>Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+influence+of+connexins+and+apical+junction+proteins+on+their+expressions+and+functions.">Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions.</a> Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 768-778 (2009).</li><li>Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+intracellular+movement+of+connexins+by+E-cadherin+in+murine+skin+papilloma+cells.">Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells.</a> Exp Cell Res. 270 (2), 235-247 (2001).</li><li>Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+(Forster)+resonance+energy+transfer+imaging+of+oncogene+activity+in+living+cells.">Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells.</a> Cancer Sci. 97 (1), 8-15 (2006).</li><li>Gustafsdottir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays+for+sensitive+and+specific+protein+analyses.">Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses.</a> Anal Biochem. 345 (1), 2-9 (2005).</li><li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+mammary+gland+development+and+function+in+mouse+models.">Evaluation of mammary gland development and function in mouse models.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).</li><li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+methodology+for+reliable+quantification+of+Western+blot+data.">A defined methodology for reliable quantification of Western blot data.</a> Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).</li><li>Oxford, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+composition+of+the+intercalated+disc+in+a+spontaneous+canine+animal+model+of+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia/cardiomyopathy.">Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy.</a> Heart Rhythm. 4 (9), 1196-1205 (2007).</li><li>Wang, X., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+mislocalization:+mechanisms,+functions+and+clinical+applications+in+cancer.">Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer.</a> Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 13-25 (2014).</li><li>Bertocchi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+architecture+of+cadherin-based+cell+adhesions.">Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions.</a> Nat Cell Biol. 19 (1), 28-37 (2017).</li><li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Fluorescent+Protein+FRET+Pairs.">A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs.</a> Sensors (Basel). 16 (9), (2016).</li><li>Fredriksson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+proteins+surrounding+occludin+and+claudin-4+reveals+their+proximity+to+signaling+and+trafficking+networks.">Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks.</a> PLoS One. 10 (3), e0117074 (2015).</li><li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays:+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox.">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).</li><li>Malovannaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+analysis+schema+for+high-throughput+identification+of+endogenous+protein+complexes.">Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).</li></ol>

접합부를 통한 세포 - 세포 상호 작용은 유방샘과 같은 많은 기관의 적절한 기능과 발달에 필요합니다. 연구 결과 junctional 단백질은 서로의 기능과 안정성을 조절할 수 있고 세포막에서 서로 연결되어 신호 전달을 활성화 할 수 있습니다. 현재의 원고에 제시된 프로토콜은 접합 단백질의 차별화 된 발현, 위치 및 정상적인 쥐의 혈관 발달 중 상호 작용에 대한 흥미있는 발견을 제공했다. junctional ?...

유선의 성장 및 발달은 주로 출생 후 발생합니다. 이 기관은 포유류의 번식을 통해 끊임없이 변모합니다 1 . 성인 유선 선 상피는 내막 상피 세포의 내층과 기저 세포의 외층으로 이루어져 있으며, 주로 상피 세포로 이루어져 있으며 기저막으로 둘러싸여있다. 유선 구조와 발달에 대한 좋은 검토를 위해 독자는 Sternlicht 1 을 참고할 수 있습니다. 글 랜드 1 , 3 , 4 , 5 , 6 의 정상적인 발달과 기능을 위해서는 gap (GJ), tight (TJ), adherens (AJ) junction을 통한 세포 - 세포 상호 작용이 필요합니다. 쥐 유선에서 이들 접합부의 주요 구성 요소는 Cx26, Cx30, Cx32 및 Cx43 (GJ)입니다. 클로 딘 -1, -3, -4, -7 그리고ZO-1 (TJ); 및 E-cadherin, P-cadherin 및 β-catenin (AJ) 7,8 . 이러한 서로 다른 접합 단백질의 발현 수준은 유선 발달 동안 단계에 따라 달라 지므로 차별화 된 세포 - 세포 상호 작용 요구 사항을 제시합니다. GJ, TJ 및 AJ는 구조적 및 기능적으로 연결되어 있고 인접한 세포의 인접한 사이트에 다른 구조적 또는 조절 단백질을 연결하여 교차 결합 관계를 만듭니다. junctional 연결의 구성은 기본 cytoskeleton뿐만 아니라 넥서스 투자율과 안정성과 다리에 영향을 미칠 수 있으며 결과적으로 글 랜드의 기능에 영향을 줄 수 있습니다 8 , 9 , 10 , 11 . 접합부 넥서스에 있거나 서로 다른 곳에서 상호 작용하는 세포 간 접합의 구성 요소최근 유방암 발달 단계를 co-immunofluorescence (co-IF)와 co-immunoprecipitation (co-IP)을 이용하여 분석 하였다. 다른 기술은 단백질 간의 기능적 연관성을 평가할 수 있지만,이 방법은이 원고에 제시되어 있지 않습니다. 단백질은 단지 기능 만 수행하기 때문에 신호 전달 및 생화학 적 계통과 같은 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPI)을 연구하는 것은 많은 연구자에게 필수적이며 단백질의 기능에 대한 중요한 정보를 제공 할 수 있습니다. 공동 IF 및 현미경 분석은 동일한 세포 내 공간을 공유하는 몇 가지 단백질을 평가하는 데 도움이됩니다. 그러나 다른 동물에서 키워야하는 항체와 다른 파장의 레이저가 장착 된 공 촛점 현미경 및 멀티플렉싱을위한 스펙트럼 검출기를 사용하여 표적의 수를 제한합니다. Co-IP는 친화적 인 물리적 상호 작용을 확인하거나 공개합니다.단백질 복합체 내에 존재하는 둘 이상의 단백질. 단백질의 위치와 상호 작용을 동시에 감지 할 수있는 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 12 및 근접 연결 분석 (PLA) 13 과 같은 새로운 기술의 개발에도 불구하고, co-IP는 적절한 상호 작용을 연구하는 적절한 기술이다 내생 단백질. 이 원고에서 설명한 단계별 방법은 유방 땀샘의 내인성 PPI를 연구 할 때 피하기 위해 단백질 지방화 및 PPI의 연구를 촉진하고 함정을 지적합니다. 이 방법론은 각 기술에 필요한 조직에 대한 다양한 보존 절차를 제시하는 것으로 시작합니다. 1 부는 i) 유방 땀샘의 구분, ii) co-IF 기법을 이용한 여러 단백질의 이중 또는 삼중 표지, iii)단백질 지방화. Part 2는 내인성 단백질을 침전시키고 상호 작용하는 단백질을 i) 용 해물 준비, ii) 간접 단백질 면역 침전 및 iii) SDS-PAGE 및 Western blot에 의한 결합 파트너 식별의 세 단계로 식별하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜의 각 단계는 설치류 유선 조직에 최적화되어 있으며 고품질의 특이적이고 재현 가능한 결과를 생성합니다. 이 프로토콜은 다른 조직이나 세포주의 PPI 연구의 시작점으로 사용할 수도 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice strain and stage&#160;</td>
			<td>St. Constant, Quebec, Canada</td>
			<td></td>
			<td>C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X (stock)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Dissolve 80g NaCl (F.W.: 58.44), 2g KCl (F.W. 74.55), 26.8g Na2HPO4&#8226;7H2O (F.W. 268.07) and 2.4g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800ml distilled water.&#160; 
			2)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Adjust the PH to 7.4&#160; 
			3)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Add water to reach to the 1 litre final volume.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS 10X (stock)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Dissolve 60.5g TRIS, 87.6g NaCl in 800ml distilled water.&#160; 
			2)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Adjust the PH to 7.5&#160; 
			3)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Add water to reach to the 1 litre final volume.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Part 1-Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing media</td>
			<td>VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada</td>
			<td>95067-840</td>
			<td>VMR frozen sections compound&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>956640</td>
			<td>Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115V 60Hz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>C.L. Sturkey, Inc. Les Produits&#160;Scientifiques&#160;ESBE&#160;St-Laurent, QC, Canada</td>
			<td>&#160;BLM1001C</td>
			<td>High profile gold coated blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td>Cedarlane, Burlington, ON, Canada</td>
			<td>8899</td>
			<td>Super PAP Pen, Thermo fisher scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic slides</td>
			<td>Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Fisherbrand&#160;Superfrost Plus Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada</td>
			<td>FOR201.1</td>
			<td>Forlmadehyde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3% BSA in TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TBS-Tween 20 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Oakville, ON, Canada</td>
			<td>P 9416</td>
			<td>Tween 20, Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Cedarlane, Burlington, ON</td>
			<td>17984-25(EM)</td>
			<td>Fluoromount-G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First &#38; secondary antibodies&#160;</td>
			<td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td>
			<td>Mentioned in Column D</td>
			<td>E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First &#38; secondary antibodies&#160;</td>
			<td>Life technologies, Waltham, MA, USA &#38; Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td>
			<td>Mentioned in Column D</td>
			<td>Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First &#38; secondary antibodies&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada&#160;</td>
			<td>Mentioned in Column D</td>
			<td>&#946;-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First &#38; secondary antibodies&#160;</td>
			<td>Life technologies, Waltham, MA, USA &#38; Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td>
			<td>Mentioned in Column D</td>
			<td>Connexin26&#160; (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei stain</td>
			<td>Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada</td>
			<td>D1306</td>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1000 in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon Canada, Mississauga, On, Canada</td>
			<td></td>
			<td>Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software of IF images analysis</td>
			<td>Nikon Canada, Mississauga, On, Canada</td>
			<td></td>
			<td>NIS-elements software (version 4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Part 2-Immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple-detergent Lysis buffer (100ml) pH=8.0&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1) Mix 50mM TRIS (F.W.&#160;:121.14), 150mM NaCl (F.W.&#160;:58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80ml distilled H2O.&#160; 
			2) Adjust the PH to 8.0 with HCl 6N (~0.5ml). 
			3) Adjust the volume to 100ml. Keep it in fridge.&#160; 
			At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: 
			Sodium Fluorid (stock) solution 1.25M (F.W. 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1M (F.W.: 183.9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease/phosphatase inhibitor</td>
			<td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td>
			<td>78441</td>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein dosage</td>
			<td>Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA</td>
			<td>23225</td>
			<td>Pierce BCA protein assay kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinder</td>
			<td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td>
			<td>FTH-115</td>
			<td>Power 125, Model FTH-115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic beads and stand</td>
			<td>Millipore, Etobicoke, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td>PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash solution for IP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies for immunoprecipitation</td>
			<td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td>
			<td>Mentioned in coulmn D</td>
			<td>IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 &#181;l/200 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies for immunoprecipitation</td>
			<td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td>
			<td>Mentioned in coulmn D</td>
			<td>IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 &#181;l/200 &#181;l&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies for immunoprecipitation</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada</td>
			<td>Mentioned in coulmn D</td>
			<td>Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 &#181;l/200 &#181;l&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies for immunoprecipitation</td>
			<td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td>
			<td>Mentioned in coulmn D</td>
			<td>E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 &#181;l/200 &#181;l&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli buffer&#160;</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada</td>
			<td>1610747</td>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer (Add &#946;-mercaptoethanol following manufacturer recommendation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic glycine&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td>
			<td>PB381-5</td>
			<td>0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>1 M (pH=8)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE acrylamide gels&#160;</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>1610180 -5</td>
			<td>TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Running buffer 10x&#160;</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>1704272</td>
			<td>Tris 30.3g/glycine 144.1g /SDS 10g in 1 litre distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membranes</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>1704272</td>
			<td>PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer method</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>1704155</td>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Milk</td>
			<td>Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td>Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution for blots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing solutions for blots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TBS-Tween 20 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary and secondary antibodies for blots (10ml)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario &#38; Abcam, Toronto, ON, Canada</td>
			<td>Mentioned in column D</td>
			<td>Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary and secondary antibodies for blots (10ml)</td>
			<td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA &#38; Abcam, Toronto, ON, Canada</td>
			<td>Mentioned in column D</td>
			<td>E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody&#160; (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary and secondary antibodies for blots (10ml)</td>
			<td>Life technologies, Waltham, MA, USA &#38; Abcam, Toronto, ON, Canada</td>
			<td>Mentioned in column D</td>
			<td>Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366)&#160; 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary and secondary antibodies for blots (10ml)</td>
			<td>Life technologies, Waltham, MA, USA &#38; Abcam, Toronto, ON, Canada</td>
			<td>Mentioned in column D</td>
			<td>Claudin3&#160; (#34-1700) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody&#160; (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol solution for signal detection on blots</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>1705061&#160;</td>
			<td>Clarity Western ECL Blotting Substrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging blots</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>1708280</td>
			<td>ChemiDoc MP imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analayzing blots</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td>ImageLab 5.2 software&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of protein-protein interactions and co-localization between components of gap, tight, and adherens junctions in murine mammary glands

세포 - 세포 상호 작용은 조직의 보전과 유방의 여러 구획 사이의 장벽을 보존하는 데 중추적 인 역할을합니다. 이러한 상호 작용은 인접 세포간에 넥서스를 형성하는 접합 단백질에 의해 제공됩니다. Junctional protein mislocalization과 결합 파트너와의 물리적 연관성 감소는 기능 상실, 결과적으로 장기 기능 부전을 초래할 수 있습니다. 따라서 정상 및 질병 관련 조직에서 단백질 위치 파악 및 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPI)을 확인하는 것은 발달 상태의 질병이나 변화의 진행을 유도하는 새로운 증거와 메커니즘을 찾는 데 필수적입니다. 이 원고는 마우스 유선에서 PPI를 평가하는 2 단계 방법을 제시합니다. 프로토콜 섹션 1에서는 관심있는 단백질에 대해 생성 된 항체와 형광 색소로 표지 된 2 차 항체를 사용하여 동시 면역 형광 (co-immunofluorescence) (co-IF)을 수행하는 방법을 설명합니다. co-IF all단백질의 근접성을 입증해야하기 때문에 신체적 상호 작용을 연구하는 것이 가능합니다. 따라서 co-immunoprecipitation (co-IP)에 대한 자세한 프로토콜은 프로토콜 섹션 2에 나와 있습니다.이 방법은 이러한 상호 작용이 직접적인지 간접적인지를 확인하지 않고 단백질 간의 물리적 상호 작용을 결정하는 데 사용됩니다. 지난 몇 년 동안 co-IF 및 co-IP 기술은 유 전선 발달 동안 변이성 접합부 연결을 생성하면서 세포 간 접합의 특정 구성 요소가 함께 위치하고 상호 작용한다는 것을 입증했습니다.

유방 내에서 GJ, AJ 및 TJ 성분이 상호 작용할 수 있는지를 결정하기 위해 co-IF 분석이 먼저 수행되었습니다. GJ 단백질 인 Cx26과 AJ 단백질 인 β-Catenin을 각각 특정 항체로 탐침하고 fluorophore-conjugated 마우스 -647 (녹색, pseudocolor) 및 염소 -568 (적색) 항체를 사용하여 나타냈다 ( 그림 1B 및 C ) . 데이터는 노란 색 ( 그림 1D )에 의해 반영된 바와...

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Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

세포 간 접합은 유선의 단계별 기능과 발달에 필수적입니다. 이 원고는 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPIs) 연구를위한 상세한 프로토콜과 쥐 유방 땀샘을 이용한 공동 위치 파악을 제공합니다. 이러한 기술은 서로 다른 발달 단계에서 세포 간 접합 사이의 물리적 연관성의 역 동성을 조사 할 수있게 해줍니다.

Murine Mammary Gland의 갭, 타이트 및 Adherens 접합부의 구성 요소 사이의 단백질 - 단백질 상호 작용 및 공동 위치 분석

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

연구

발생학

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

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활성 ERK의 공간 및 시간 분석<em&gt; C. 엘레</em&gt; 생식선

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

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셀 리니지 마커의 공동 현지화와 토마토 신호

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

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약물 치료와<em&gt; 생체</em&gt;은 메다카 물고기 골다공증 모델에서 조골 파골 세포 상호 작용의 영상

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의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

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extracellular vesicles / exosomes를 통한 유방 기초 상피 세포와 유방 Luminal 세포 사이 유선 형성 능력의 이전

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Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method

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