Name: genome-wide mapping of protein-dna interactions with chec-seq in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2017-06-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

نشكر مصطفى صالح وجاي توريغني على قراءة نقدية للمخطوطة وستيفن هان وستيفن هينيكوف للحصول على الإرشاد والدعم خلال تطوير تشيك-سيق وتطبيقه على مجمع الوسيط. ويدعم سغ من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01GM053451 و R01GM075114 و جيز هو معتمد من قبل صناديق بدء تشغيل جامعة إنديانا.

1. جيل من سلالات الخميرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد سلالة الخميرة التي تحمل عامل الفائدة الموسومة مع منيس. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ير تضخيم كاسيت منيس علامات من ناقلات المطلوب ( الجدول 1 ) باستخدام...

<ol>
	<li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nat Commun. 6, 8733 (2015).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Dynamics+of+Enhanceosome+Assembly+in+Embryonic+Stem+Cells.">Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).</li><li>Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+expressed+loci+are+vulnerable+to+misleading+ChIP+localization+of+multiple+unrelated+proteins.">Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).</li><li>Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+Misinterpretable+ChIP-seq+Bias+in+Yeast.">Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast.</a> PLoS ONE. 8 (12), 83506 (2013).</li><li>Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+promoters+give+rise+to+false+positive+'Phantom+Peaks'+in+ChIP-seq+experiments.">Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li><li>Krebs, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+transcription+factor+binding+map+accuracy+utilizing+knockout-mouse+models.">Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models.</a> Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).</li><li>Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Association+of+Mediator+and+RNA+Polymerase+II+in+Wild-Type+and+Mediator+Mutant+Yeast.">Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast.</a> Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).</li><li>Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-targeted+transcription+factors+motifs+are+a+systemic+component+of+ChIP-seq+datasets.">Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets.</a> Genome Biol. 15 (7), 412 (2014).</li><li>Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+Signals+in+Sequencing-Based+Chromatin-ImmunoPrecipitation+Control+Libraries.">Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries.</a> PLoS ONE. 4 (4), 5241 (2009).</li><li>Teytelman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Chromatin+Structures+on+DNA+Processing+for+Genomic+Analyses.">Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses.</a> PLoS ONE. 4 (8), 6700 (2009).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Genome-wide+Protein-DNA+Interactions+Detected+at+Single-Nucleotide+Resolution.">Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li><li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints.">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).</li><li>Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+of+transcription+factor+binding+sites+on+native+chromatin.">High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin.</a> Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).</li><li>Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleosomal+barrier+to+promoter+escape+by+RNA+polymerase+II+is+overcome+by+the+chromatin+remodeler+Chd1.">The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1.</a> eLife. 3, 02042 (2014).</li><li>Aughey, G. N., Southall, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dam+it's+good!+DamID+profiling+of+protein-DNA+interactions.">Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).</li><li>Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calling+Cards+enable+multiplexed+identification+of+the+genomic+targets+of+DNA-binding+proteins.">Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins.</a> Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIC+and+ChEC:+Genomic+Mapping+of+Chromatin+Proteins.">ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins.</a> Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Merz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actively+transcribed+rRNA+genes+in+S.+cerevisiae+are+organized+in+a+specialized+chromatin+associated+with+the+high-mobility+group+protein+Hmo1+and+are+largely+devoid+of+histone+molecules.">Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules.</a> Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).</li><li>Schmid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nup-PI:+The+Nucleopore-Promoter+Interaction+of+Genes+in+Yeast.">Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast.</a> Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).</li><li>Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cellular+Ca2++by+yeast+vacuoles.">Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles.</a> J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).</li><li>Gr&#252;nberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediator+binding+to+UASs+is+broadly+uncoupled+from+transcription+and+cooperative+with+TFIID+recruitment+to+promoters.">Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters.</a> The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li><li>Rohland, N., Reich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective,+high-throughput+DNA+sequencing+libraries+for+multiplexed+target+capture.">Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture.</a> Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).</li><li>Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K., Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+regulatory+factors+by+immunoprecipitation+from+native+chromatin.">Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin.</a> Current protocols in molecular biology. 110, 21-25 (2015).</li><li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Combinations+of+Lineage-Determining+Transcription+Factors+Prime+cis-Regulatory+Elements+Required+for+Macrophage+and+B+Cell+Identities.">Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities.</a> Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li><li>Kungulovski, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+histone+modification-specific+interaction+domains+as+an+alternative+to+antibodies.">Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies.</a> Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).</li><li>Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+using+DamID+in+mammalian+cells.">Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).</li><li>Feeser, E. A., Wolberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+Functional+Studies+of+the+Rap1+C-Terminus+Reveal+Novel+Separation-of-Function+Mutants.">Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants.</a> J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).</li><li>Neph, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expansive+human+regulatory+lexicon+encoded+in+transcription+factor+footprints.">An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints.</a> Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).</li><li>Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocortin+receptor-mediated+mobilization+of+intracellular+free+calcium+in+HEK293+cells.">Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells.</a> Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).</li><li>Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-Like+Growth+Factor+Binding+Proteins+Increase+Intracellular+Calcium+Levels+in+Two+Different+Cell+Lines.">Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines.</a> PLoS ONE. 8 (3), e59323 (2013).</li><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Calcium+in+Neurons.">Imaging Calcium in Neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Filion, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Protein+Location+Mapping+Reveals+Five+Principal+Chromatin+Types+in+Drosophila+Cells.">Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells.</a> Cell. 143 (2), 212-224 (2010).</li><li>van Bemmel, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Network+Model+of+the+Molecular+Organization+of+Chromatin+in+Drosophila.">A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila.</a> Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).</li><li>Izzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genomic+Landscape+of+the+Somatic+Linker+Histone+Subtypes+H1.1+to+H1.5+in+Human+Cells.">The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells.</a> Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).</li></ol>

لقد أظهرنا أن تشيك يمكن تعيين فئات متنوعة من البروتينات الخميرة على الكروماتين، وتوقع أنه سيتم تطبيقها على نطاق واسع على عائلات مختلفة من صناديق الاستئناف وغيرها من العوامل ملزم الكروماتين في الخميرة. تشيك-سيق هو مفيد في أنه لا يتطلب كروسلينكينغ، لونين سولوبيليزات?...

رسم الخرائط مواقع ملزمة من عوامل النسخ (تفس)، إعادة تشكيل الكروماتين، والعوامل التنظيمية الأخرى المرتبطة بالكروماتين هو المفتاح لفهم جميع العمليات القائمة على الكروماتين. في حين استخدمت المناعية لونين وارتفاع تسلسل الإنتاجية (تشيب-سيق) نهج لكسب العديد من الأفكار الهامة في علم الأحياء الجينوم، لديهم قيود ملحوظة. لقد أدخلنا مؤخرا طريقة بديلة، يطلق عليها الانقسام الداخلي لونين والإنتاجية العالية تسلسل (تشيك-سيق) 1 ، للتحايل على هذه السلبيات. وغالبا ما يتم تنفيذ تشيب-سيق مع خطوة الفورمالديهايد الأولي يشابك (X- رقاقة-سيق) للحفاظ على التفاعلات البروتين الحمض النووي. ومع ذلك، فقد أشار عدد من الدراسات الحديثة أن X-تشيب-سيق يلتقط التفاعلات البروتين الحمض النووي عابرة أو غير محددة 2 ، 3 ، 4 ، 5 &lt;سوب&gt;، 6 ، 7 ، 8 ، مما يؤدي إلى مواقع ملزمة إيجابية كاذبة. وبالإضافة إلى ذلك، سونيكاتيون، وتستخدم عادة لتفريق لونين في التجارب X- تشيب-سيق، مناطق المقصات تفضيلي من لونين مفتوح، مما يؤدي إلى الانتعاش منحازة شظايا من هذه المناطق 9 ، 10 . سونيكاتيون ينتج أيضا خليط غير متجانسة من أطوال الشظايا، مما يحد في نهاية المطاف قرار الموقع ملزمة، على الرغم من أن إضافة خطوة الهضم نوكلياز يمكن أن تحسن كثيرا القرار 11 ، 12 . طرق رقاقة المحلية مثل المناطق المحتلة من الجينوم من تقارب تنقيته لونين معزولة طبيعيا (أورغانيك) 13 لا تستخدم كروسلينكينغ وشظية لونين مع نوكلياز ميكروكوكال (منيس)، والتخفيف من التحيزات المحتملة المرتبطة التشابك الفورمالديهايد وسونيكاتيون. ومع ذلك،فإن ذوبانية العديد من البروتينات المرتبطة بالكروماتين في ظل ظروف خفيفة نسبيا المطلوبة لاستخراج الكروماتين الأصلي ضعيف، مما قد يؤدي إلى انخفاض النطاق الديناميكي و / أو السلبيات الكاذبة 14 . في حين أن التكرارات المختلفة من تشيب سيق، هي الأكثر شيوعا لرسم الخرائط على نطاق الجينوم من التفاعلات الحمض النووي للبروتين، كما تم تنفيذ عدة تقنيات رسم الخرائط على أساس انصهار البروتينات التي تهم مختلف الأنزيمات تعديل الحمض النووي. واحد من هذه النهج هو دنا أدينين ميثيل ترانسفيراس تحديد (داميد) 15 ، حيث يتم دمج البروتين ملزم من الكروماتين من الفائدة إلى وراثيا ويتم التعبير عن هذا الانصهار في الخلايا أو الحيوانات، مما أدى إلى مثيلة من تسلسل غاتس القريبة لمواقع ملزمة للبروتين. داميد مفيد في أنه لا يعتمد على مناعي وهكذا يتجنب التشابك، الأجسام المضادة، أو لونين الانحلال. كما يتم تنفيذها في الجسم الحي . ومع ذلك، يقتصر قرار داميد على مقياس الكيلوباس ونشاط الميثيلات من بروتين الدم الانصهار هو كونستيتوتيف. وهناك طريقة ثانية تقوم على الانزيم الانزيمية هي استدعاء بطاقة- 16 ، الذي يوظف الانصهار من عامل من الفائدة إلى ترانسبوزاز، توجيه التكامل موقع معين من ترانسبوسونس. مثل داميد، استدعاء بطاقة المتابعة لا يستند إلى إمونوبريسيانتاتيون وبالتالي لديها مزايا مماثلة، مع فائدة إضافية من زيادة القرار. ومع ذلك، قد تقيد بطاقة الاتصال المتابعة بالتسلسل التحيز من ينتقل ويعتمد أيضا على وجود مواقع تقييد قريبة من مواقع الإدراج ترانزوسون. وهناك طريقة الانزيمية الثالثة الانصهار، وضعت في مختبر لامللي، هو لونين الانقسام الذاتية (تشيك) 17 . في تشيك، يتم التعبير عن الانصهار بين البروتين المرتبط بالكروماتين و منيس في الخلايا، وعلى إضافة الكالسيوم لتنشيط منيس، يتم تشريح الحمض النووي الأقرب إلى مواقع ملزمة للموسومةعامل ( الشكل 1 ). جنبا إلى جنب مع النشاف الجنوبية، وقد استخدمت تشيك لتوصيف هيكل الكروماتين والبروتين ملزمة في عدد من لوكسي الفردية في الخميرة 17 ، 18 ، وتم دمجها مع تحليل ميكروأري منخفضة الدقة للتحقيق في التفاعل من مكونات المسام النووية مع الخميرة الجينوم 19 . تشيك يقدم فوائد مماثلة ل داميد و بطاقة دعوة المتابعة، وقرارها هو تقريبا زوج واحد قاعدة عند تحليل التمديد التمهيدي 19 . تشيك هو أيضا يمكن السيطرة عليها: الانقسام الحمض النووي قوي مناس يعتمد على إضافة مليمولار الكالسيوم، وضمان أن منيس غير نشط في تركيزات منخفضة الكالسيوم الحرة لوحظ في خلايا الخميرة الحية 20 . في السابق، افترضنا أن الجمع بين تشيك مع تسلسل الإنتاجية العالية (تشيك-سيق) من شأنه أن يوفر خرائط عالية الدقة من مواقع الربط تف. في الواقع، تشيك-sq ولدت خرائط عالية الدقة من الخميرة الناشئة العوامل التنظيمية العامة (غرفس) Abf1، Rap1، و Reb1 عبر الجينوم 1 . وقد نجحنا أيضا في تطبيق تشيك-سيق على مجمع الوسطاء المعياري، وهو عامل حفظي عالمي أساسي محفظ 21 ، وتوسيع نطاق تطبيق تشيك-سيق إلى مجمعات الحجم ميغادالتون التي لا تتصل مباشرة دنا وقد يكون من الصعب رسم بواسطة رقاقة- . تشيك-سيق هو وسيلة قوية على حد سواء للتحقق من صحة مستقلة النتائج تشيب-سيق وتوليد رؤى جديدة في تنظيم العمليات المقيمين الكروماتين. هنا، نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لتنفيذ هذه الطريقة في مهدها الخميرة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">dNTPs</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0447</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Q5 high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0491L</td>
			<td>Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10488085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0273L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:307px;">cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11836170001</td>
			<td>It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit Mnase cleavage by chelation of Ca2+.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">PMSF</td>
			<td style="width:159px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC215740010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Digitonin, High Purity</td>
			<td style="width:159px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">300410-250MG</td>
			<td>Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Proteinase K, 20 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">RNase A, 10 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Ampure XP beads</td>
			<td style="width:159px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td>Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">MagneSphere magnetic rack</td>
			<td style="width:159px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">Z5342</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide mapping of protein-dna interactions with chec-seq in saccharomyces cerevisiae

رسم الخرائط على نطاق الجينوم من التفاعلات البروتين الحمض النووي أمر بالغ الأهمية لفهم التنظيم الجيني، وإعادة عرض لونين، وغيرها من العمليات المقيمين الكروماتين. الفورمالديهايد يشابك تليها لونين مناعي وارتفاع الإنتاجية الإنتاجية (X-تشيب-سيق) وقد استخدمت لكسب العديد من الأفكار القيمة في علم الأحياء الجينوم. ومع ذلك، X-تشيب-سيق لديه قيود مرتبطة مرتبطة كروسلينكينغ وسونيكاتيون. رقاقة الأصلي تجنب هذه العيوب عن طريق حذف تشابك، ولكن غالبا ما يؤدي إلى الانتعاش الفقراء من البروتينات المرتبطة الكروماتين. وبالإضافة إلى ذلك، فإن جميع الطرق القائمة على رقاقة تخضع لاعتبارات الجودة الأجسام المضادة. وقد استخدمت أيضا أساليب الأنزيمية لرسم خرائط التفاعلات الحمض النووي للبروتين، والتي تنطوي على الانصهار من البروتين من الاهتمام لانزيم تعديل الحمض النووي، لتعيين التفاعلات البروتين الحمض النووي. نحن في الآونة الأخيرة مجتمعة واحدة من هذه الطريقة، لونين الانقسام الذاتية (تشيك)، مع تسلسل الإنتاجية العالية كما تشيك-سيق. تشيك-سيق يعتمد على الانصهار من الكروماتين- أسوكالبروتين إاتد من الفائدة إلى نوكلياز ميكروكوكال (منيس) لتوليد استهداف الحمض النووي الانقسام في وجود الكالسيوم في الخلايا الحية. تشيك-سيق لا يقوم على إمونوبريسيانتاتيون وبالتالي التحايل على المخاوف المحتملة مع يشابك، صوتنة، لونين سولوبيليزاتيون، وجودة الأجسام المضادة مع توفير عالية الدقة رسم الخرائط مع الحد الأدنى من إشارة الخلفية. ونحن نتصور أن تشيك-سيق سوف تكون نظير قوي ل تشيب، وتوفير وسيلة مستقلة من أجل التحقق من صحة النتائج تشيب-سيق، واكتشاف رؤى جديدة في التنظيم الجيني.

<html> في حالة تجربة تشيك ناجحة، وتحليل الحمض النووي من قبل الاغاروز هلام الكهربائي تكشف عن زيادة تعتمد على الكالسيوم في تجزئة الحمض النووي على مدى الوقت، كما هو مبين من قبل تلطيخ والهضم النهائي النهائي من الحمض النووي الجيني. في بعض الحالات، لوحظ سلم ?...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

نحن تصف الكروماتين الانقسام الذاتية إلى جانب تسلسل عالية الإنتاجية (تشيك-سيق)، المناعية لونين (رقاقة) طريقة متعامدة لرسم الخرائط مواقع ملزمة البروتين الجينوم على نطاق واسع مع نوكليس نوكوكلياز (منيس) البروتينات الانصهار.

رسم الخرائط على نطاق الجينوم من التفاعلات البروتين الحمض النووي مع تشيك-سيق في<em&gt; ساكاروميسز سيريفيسياي</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

تحديد الجينوم على نطاق توقيت النسخ المتماثل الثدييات بواسطة الحمض النووي قياس المحتوى

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

رسم الخرائط التفاعلات رنا-رنا على الصعيد العالمي باستخدام السورالين البيروكسيديز

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

رسم خرائط الجينوم المنظومة الكروماتين موجوداً في الخلايا الليمفاوية تي البشرية الأولية التي أتاك-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

تحديد معدلات تسوس نسخة على نطاق الجينوم في الخلايا الليفية البشرية المتكاثرة وهادئة

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

جيل من الكروماتين على نطاق الجينوم تكيف التقاط المكتبات من الأجنة المورفولوجية محكم نظموا في وقت مبكر

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) من "التعديلات هستون" من Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

مروج التقاط مرحبا c: عالية الاستبانة، وعلى نطاق الجينوم التنميط التفاعلات المروج

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

المراقبة على نطاق الجينوم من أخطاء النسخ في الكائنات الحية حقيقية النواة

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae الأيضية وسم مع 4-ثيوراسيل والتحديد الكمي حديثا توليفها مرناً كوكيل للنشاط الثاني رنا بوليميراز

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

رسم الخرائط الوراثية للاختلافات التسامح الحراري بين أنواع الخميرة Saccharomyces عن طريق تحليل الهيميزيغوستي على نطاق الجينوم المتبادل

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...