Name: genome-wide mapping of protein-dna interactions with chec-seq in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2017-06-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Nous remercions Moustafa Saleh et Jay Tourigny pour la lecture critique du manuscrit et Steven Hahn et Steven Henikoff pour le mentorat et le soutien lors du développement de ChEC-seq et son application au complexe Mediator. SG est soutenu par les subventions du NIH R01GM053451 et R01GM075114 et GEZ est soutenu par les fonds de démarrage de l&#39;Université d&#39;Indiana.

1. Génération de souches de levure <ol><li> Générer une souche de levure portant le facteur d&#39;intérêt marqué avec MNase. <ol><li> La PCR amplifie la cassette de marquage MNase du vecteur souhaité ( Tableau 1 ) en utilisant le mélange réactionnel spécifié ( Tableau 2 ) et les conditions cycliques ( Tableau 3 ). Mélanger 5 μL de la réaction de PCR et 1 μL de colorant de chargement d&#39;ADN 6X. Exécutez chaque portion aliquote de PC...

<ol>
	<li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nat Commun. 6, 8733 (2015).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Dynamics+of+Enhanceosome+Assembly+in+Embryonic+Stem+Cells.">Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).</li><li>Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+expressed+loci+are+vulnerable+to+misleading+ChIP+localization+of+multiple+unrelated+proteins.">Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).</li><li>Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+Misinterpretable+ChIP-seq+Bias+in+Yeast.">Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast.</a> PLoS ONE. 8 (12), 83506 (2013).</li><li>Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+promoters+give+rise+to+false+positive+'Phantom+Peaks'+in+ChIP-seq+experiments.">Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li><li>Krebs, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+transcription+factor+binding+map+accuracy+utilizing+knockout-mouse+models.">Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models.</a> Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).</li><li>Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Association+of+Mediator+and+RNA+Polymerase+II+in+Wild-Type+and+Mediator+Mutant+Yeast.">Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast.</a> Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).</li><li>Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-targeted+transcription+factors+motifs+are+a+systemic+component+of+ChIP-seq+datasets.">Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets.</a> Genome Biol. 15 (7), 412 (2014).</li><li>Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+Signals+in+Sequencing-Based+Chromatin-ImmunoPrecipitation+Control+Libraries.">Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries.</a> PLoS ONE. 4 (4), 5241 (2009).</li><li>Teytelman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Chromatin+Structures+on+DNA+Processing+for+Genomic+Analyses.">Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses.</a> PLoS ONE. 4 (8), 6700 (2009).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Genome-wide+Protein-DNA+Interactions+Detected+at+Single-Nucleotide+Resolution.">Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li><li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints.">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).</li><li>Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+of+transcription+factor+binding+sites+on+native+chromatin.">High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin.</a> Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).</li><li>Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleosomal+barrier+to+promoter+escape+by+RNA+polymerase+II+is+overcome+by+the+chromatin+remodeler+Chd1.">The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1.</a> eLife. 3, 02042 (2014).</li><li>Aughey, G. N., Southall, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dam+it's+good!+DamID+profiling+of+protein-DNA+interactions.">Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).</li><li>Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calling+Cards+enable+multiplexed+identification+of+the+genomic+targets+of+DNA-binding+proteins.">Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins.</a> Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIC+and+ChEC:+Genomic+Mapping+of+Chromatin+Proteins.">ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins.</a> Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Merz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actively+transcribed+rRNA+genes+in+S.+cerevisiae+are+organized+in+a+specialized+chromatin+associated+with+the+high-mobility+group+protein+Hmo1+and+are+largely+devoid+of+histone+molecules.">Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules.</a> Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).</li><li>Schmid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nup-PI:+The+Nucleopore-Promoter+Interaction+of+Genes+in+Yeast.">Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast.</a> Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).</li><li>Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cellular+Ca2++by+yeast+vacuoles.">Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles.</a> J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).</li><li>Gr&#252;nberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. 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Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li><li>Rohland, N., Reich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective,+high-throughput+DNA+sequencing+libraries+for+multiplexed+target+capture.">Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture.</a> Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).</li><li>Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K., Ausubel, F. 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J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+using+DamID+in+mammalian+cells.">Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).</li><li>Feeser, E. A., Wolberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+Functional+Studies+of+the+Rap1+C-Terminus+Reveal+Novel+Separation-of-Function+Mutants.">Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants.</a> J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).</li><li>Neph, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expansive+human+regulatory+lexicon+encoded+in+transcription+factor+footprints.">An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints.</a> Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).</li><li>Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocortin+receptor-mediated+mobilization+of+intracellular+free+calcium+in+HEK293+cells.">Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells.</a> Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).</li><li>Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-Like+Growth+Factor+Binding+Proteins+Increase+Intracellular+Calcium+Levels+in+Two+Different+Cell+Lines.">Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines.</a> PLoS ONE. 8 (3), e59323 (2013).</li><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Calcium+in+Neurons.">Imaging Calcium in Neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Filion, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Protein+Location+Mapping+Reveals+Five+Principal+Chromatin+Types+in+Drosophila+Cells.">Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells.</a> Cell. 143 (2), 212-224 (2010).</li><li>van Bemmel, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Network+Model+of+the+Molecular+Organization+of+Chromatin+in+Drosophila.">A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila.</a> Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).</li><li>Izzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genomic+Landscape+of+the+Somatic+Linker+Histone+Subtypes+H1.1+to+H1.5+in+Human+Cells.">The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells.</a> Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).</li></ol>

Nous avons montré que ChEC peut cartographier diverses classes de protéines de levure sur la chromatine et anticiper qu&#39;il sera largement applicable à différentes familles de TF et d&#39;autres facteurs de liaison à la chromatine dans la levure. ChEC-seq est avantageux en ce qu&#39;il ne nécessite pas de réticulation, de solubilisation de la chromatine ou d&#39;anticorps. Ainsi, ChEC évite les artefacts potentiellement présents dans X-ChIP-seq, tels que l&#39;artefact hyper-ChIPable 3</sup...

La cartographie des sites de liaison des facteurs de transcription (TF), des remodelateurs de la chromatine et d&#39;autres facteurs réglementaires associés à la chromatine est essentielle pour comprendre tous les processus basés sur la chromatine. Bien que les approches d&#39;immunoprécipitation à la chromatine et de séquençage à haut débit (ChIP-seq) aient été utilisées pour obtenir de nombreuses connaissances importantes sur la biologie du génome, elles ont des limitations notables. Nous avons récemment introduit une méthode alternative, appelée clivage endogène de la chromatine et séquençage à haut débit (ChEC-seq) 1 , pour contourner ces inconvénients. ChIP-seq est le plus souvent réalisé avec une étape initiale de réticulation de formaldéhyde (X-ChIP-seq) pour préserver les interactions protéine-ADN. Cependant, un certain nombre d&#39;études récentes ont indiqué que X-ChIP-seq capture des interactions protéines-ADN transitoires ou non spécifiques 2 , 3 , 4 , 5 &lt;Sup&gt;, 6 , 7 , 8 , donnant lieu à des sites de liaison faussement positifs. En outre, la sonication, couramment utilisée pour fragmenter la chromatine dans les expériences X-ChIP-seq, cisaille préférentiellement les régions de la chromatine ouverte, ce qui conduit à une récupération partielle des fragments de ces régions 9 , 10 . La sonication produit également un mélange hétérogène de longueurs de fragments, limitant finalement la résolution du site de liaison, bien que l&#39;ajout d&#39;une étape de digestion par une exonucléase puisse grandement améliorer la résolution 11 , 12 . Les méthodes ChIP indigènes telles que les régions occupées des génomes provenant de la chromatine naturellement isolée purifiée par affinité (ORGANIQUE) 13 n&#39;utilisent pas de réticulation et de fragmentation de la chromatine avec la nucléase micrococcie (MNase), en atténuant les biais potentiels associés à la réticulation au formaldéhyde et à la sonication. cependant,La solubilité de nombreuses protéines liées à la chromatine dans les conditions relativement douces requises pour l&#39;extraction de la chromatine native est médiocre, entraînant potentiellement une réduction de la dynamique et / ou des faux négatifs 14 . Alors que diverses itérations de ChIP-seq sont le plus couramment utilisées pour la cartographie génomique des interactions protéine-ADN, plusieurs techniques de cartographie basées sur la fusion de protéines d&#39;intérêt pour diverses enzymes modifiant l&#39;ADN ont également été mises en œuvre. Une telle approche est l&#39;identification par l&#39;ADN adénine méthyltransférase (DamID) 15 , dans laquelle une protéine de liaison à la chromatine est génétiquement fusionnée à Barrage et cette fusion est exprimée dans des cellules ou des animaux, entraînant une méthylation de séquences de GATC proches des sites de liaison de la protéine. DamID est avantageux en ce qu&#39;il ne repose pas sur l&#39;immunoprécipitation et évite ainsi la réticulation, les anticorps ou la solubilisation de la chromatine. Il est également réalisé in vivo . toutefois, La résolution de DamID est limitée à l&#39;échelle de kilobase et l&#39;activité de méthylation de la protéine de fusion du barrage est constitutive. Une deuxième méthode basée sur la fusion enzymatique est Calling Card-seq 16 , qui utilise une fusion d&#39;un facteur d&#39;intérêt pour une transposase, en dirigeant l&#39;intégration spécifique au site des transposons. Comme DamID, Calling Card-seq n&#39;est pas basé sur l&#39;immunoprécipitation et a donc des avantages similaires, avec l&#39;avantage supplémentaire d&#39;une résolution accrue. Toutefois, Calling Card-seq peut être limité par des biais de séquences de transposases et dépend également de la présence de sites de restriction proches des sites d&#39;insertion de transposon. Une troisième méthode de fusion enzymatique, développée dans le laboratoire de Laemmli, est le clivage endogène de la chromatine (ChEC) 17 . Dans ChEC, une fusion entre une protéine associée à la chromatine et la MNase est exprimée dans les cellules et, après l&#39;addition de calcium pour activer la MNase, l&#39;ADN est clivé proximal aux sites de liaison pour les étiquetésFacteur ( figure 1 ). En conjonction avec Southern Blot, ChEC a été utilisé pour caractériser la structure de la chromatine et la liaison des protéines à un certain nombre de loci individuels dans la levure 17 , 18 et a été combiné avec une analyse de microarrays à basse résolution pour sonder l&#39;interaction des composants des pores nucléaires avec la levure Génome 19 . ChEC offre des avantages similaires à DamID et Calling Card-seq, et sa résolution est presque une paire de base unique lorsqu&#39;elle est analysée par l&#39;extension d&#39;amorçage 19 . ChEC est également contrôlable: le clivage d&#39;ADN robuste par MNase dépend de l&#39;ajout de calcium millimolaire, ce qui garantit que la MNase est inactive aux faibles concentrations de calcium libres observées dans les cellules vivantes 20 . Auparavant, nous avons postulé que la combinaison de ChEC avec le séquençage à haut débit (ChEC-seq) fournirait des cartes haute résolution des sites de liaison TF. En effet, ChEC-seq a généré des cartes haute résolution des facteurs de régulation généraux de la levure bourgeonnaire (GRF) Abf1, Rap1 et Reb1 à travers le génome 1 . Nous avons également appliqué avec succès ChEC-seq au complexe Mediator modulaire, un conservateur, un coactivateur de transcription global essentiel 21 , élargissant l&#39;applicabilité de ChEC-seq aux complexes de taille megadalton qui ne contactent pas directement l&#39;ADN et peuvent être difficiles à cartographier par ChIP- Méthodes basées. ChEC-seq est une méthode puissante à la fois pour la validation indépendante des résultats de ChIP-seq et la génération de nouvelles connaissances sur la régulation des processus résistant aux chromatines. Ici, nous présentons un protocole étape par étape pour la mise en œuvre de cette méthode dans la levure bourgeonnante.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">dNTPs</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0447</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Q5 high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0491L</td>
			<td>Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10488085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0273L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:307px;">cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11836170001</td>
			<td>It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit Mnase cleavage by chelation of Ca2+.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">PMSF</td>
			<td style="width:159px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC215740010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Digitonin, High Purity</td>
			<td style="width:159px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">300410-250MG</td>
			<td>Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Proteinase K, 20 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">RNase A, 10 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Ampure XP beads</td>
			<td style="width:159px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td>Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">MagneSphere magnetic rack</td>
			<td style="width:159px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">Z5342</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide mapping of protein-dna interactions with chec-seq in saccharomyces cerevisiae

La cartographie à l&#39;échelle du génome des interactions protéine-ADN est essentielle pour la compréhension de la régulation des gènes, du remodelage de la chromatine et d&#39;autres processus résistant aux chromatines. La réticulation par formaldehyde suivie de l&#39;immunoprécipitation de la chromatine et du séquençage à haut débit (X-ChIP-seq) a été utilisée pour obtenir de nombreuses informations précieuses sur la biologie du génome. Cependant, X-ChIP-seq a des limitations remarquables liées à la réticulation et à la sonication. Le ChIP indigène évite ces inconvénients en omettant la réticulation, mais entraîne souvent une mauvaise récupération des protéines liées à la chromatine. En outre, toutes les méthodes basées sur le ChIP sont soumises à des considérations de qualité d&#39;anticorps. Les méthodes enzymatiques pour cartographier les interactions protéine-ADN, qui impliquent la fusion d&#39;une protéine d&#39;intérêt pour une enzyme modifiant l&#39;ADN, ont également été utilisées pour cartographier les interactions protéine-ADN. Nous avons récemment combiné une telle méthode, le clivage endogène de la chromatine (ChEC), avec un séquençage à haut débit comme ChEC-seq. ChEC-seq repose sur la fusion d&#39;une chromatine-assocUne protéine d&#39;intérêt intéressant pour la nuclease micrococcique (MNase) génère un clivage d&#39;ADN ciblé en présence de calcium dans les cellules vivantes. Le ChEC-seq n&#39;est pas basé sur l&#39;immunoprécipitation et contourne ainsi les préoccupations potentielles liées à la réticulation, à la sonication, à la solubilisation de la chromatine et à la qualité des anticorps tout en fournissant une cartographie haute résolution avec un signal de fond minimal. Nous envisageons que ChEC-seq sera une contrepartie puissante de ChIP, fournissant un moyen indépendant permettant de valider les résultats de ChIP-seq et de découvrir de nouvelles idées sur la régulation génomique.

Dans le cas d&#39;une expérience réussie de ChEC, l&#39;analyse de l&#39;ADN par électrophorèse sur gel d&#39;agarose révélera une augmentation de la fragmentation de l&#39;ADN par rapport au calcium, comme l&#39;indiquent les frottis et la digestion éventuelle complète de l&#39;ADN génomique. Dans certains cas, une échelle de bandes similaire à celle observée avec une digestion MNase traditionnelle est observée après une digestion prolongée. C&#39;est le cas pour l&#39;an...

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Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Nous décrivons le clivage endogène de la chromatine couplé au séquençage à haut débit (ChEC-seq), une méthode orthogonale à l&#39;immunoprécipitation à la chromatine (ChIP) pour cartographier les sites de liaison des protéines à l&#39;échelle du génome avec des protéines de fusion à la nucléase micrococcie (MNase).

Cartographie génomique des interactions protéine-ADN avec ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Détermination de l&#39;échelle du génome de Timing de réplication mammalienne par l&#39;ADN Mesure Contenu

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Recherche

Génétique

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Cartographie des interactions ARN-ARN à l&#39;échelle mondiale à l&#39;aide de psoralène biotinylé

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Cartographie de tout le génome de chromatine Accessible dans les Lymphocytes T humains primaires par ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Déterminer le taux de décroissance de Genome-wide transcription dans les fibroblastes humains proliférantes et repos

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Génération de chromatine Genome-wide Conformation Capture bibliothèques d’embryons de drosophile début étroitement mise en scène

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des Modifications d’Histone de Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Capture promoteur Salut-c : Haute résolution, Genome-wide profilage des Interactions de promoteur

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Surveillance de Génome-large d’erreurs de Transcription dans les organismes eucaryotes

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Métabolique marquage avec 4-thio-uracile et la Quantification des nouvellement synthétisé ARNm comme un Proxy pour l’activité de l’ARN polymérase II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Cartographie génétique des différences de thermotolérance entre les espèces de levure saccharomyces via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...