Name: genome-wide mapping of protein-dna interactions with chec-seq in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2017-06-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

ChEC-seq 개발과 Mediator 단지 적용에 대한 조언과 지원을 위해 원고와 Steven Hahn 및 Steven Henikoff의 비판적인 독서를 위해 Moustafa Saleh와 Jay Tourigny에게 감사드립니다. SG는 NIH 보조금 R01GM053451 및 R01GM075114에서 지원되며 GEZ는 Indiana University 시작 자금에서 지원됩니다.

1. 효모 균주의 생성 <ol><li> MNase로 태그가 붙은 관심있는 인자를 가진 효모 균주를 생성하십시오. <ol><li> PCR은 특정 반응 혼합물 ( 표 2 )과 사이클링 조건 ( 표 3 )을 사용하여 원하는 벡터 ( 표 1 )에서 MNase 태깅 카세트를 증폭. 5 μL의 PCR 반응과 1 μL의 6X DNA loading dye를 섞는다. 40 분 동안 120 V에서 0.8 % 아가로 오스 겔에서 각 PCR 분액을 실행합니다. ?...

<ol>
	<li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nat Commun. 6, 8733 (2015).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Dynamics+of+Enhanceosome+Assembly+in+Embryonic+Stem+Cells.">Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).</li><li>Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+expressed+loci+are+vulnerable+to+misleading+ChIP+localization+of+multiple+unrelated+proteins.">Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).</li><li>Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+Misinterpretable+ChIP-seq+Bias+in+Yeast.">Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast.</a> PLoS ONE. 8 (12), 83506 (2013).</li><li>Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+promoters+give+rise+to+false+positive+'Phantom+Peaks'+in+ChIP-seq+experiments.">Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li><li>Krebs, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+transcription+factor+binding+map+accuracy+utilizing+knockout-mouse+models.">Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models.</a> Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).</li><li>Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Association+of+Mediator+and+RNA+Polymerase+II+in+Wild-Type+and+Mediator+Mutant+Yeast.">Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast.</a> Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).</li><li>Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-targeted+transcription+factors+motifs+are+a+systemic+component+of+ChIP-seq+datasets.">Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets.</a> Genome Biol. 15 (7), 412 (2014).</li><li>Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+Signals+in+Sequencing-Based+Chromatin-ImmunoPrecipitation+Control+Libraries.">Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries.</a> PLoS ONE. 4 (4), 5241 (2009).</li><li>Teytelman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Chromatin+Structures+on+DNA+Processing+for+Genomic+Analyses.">Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses.</a> PLoS ONE. 4 (8), 6700 (2009).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Genome-wide+Protein-DNA+Interactions+Detected+at+Single-Nucleotide+Resolution.">Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li><li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints.">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).</li><li>Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+of+transcription+factor+binding+sites+on+native+chromatin.">High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin.</a> Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).</li><li>Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleosomal+barrier+to+promoter+escape+by+RNA+polymerase+II+is+overcome+by+the+chromatin+remodeler+Chd1.">The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1.</a> eLife. 3, 02042 (2014).</li><li>Aughey, G. N., Southall, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dam+it's+good!+DamID+profiling+of+protein-DNA+interactions.">Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).</li><li>Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calling+Cards+enable+multiplexed+identification+of+the+genomic+targets+of+DNA-binding+proteins.">Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins.</a> Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIC+and+ChEC:+Genomic+Mapping+of+Chromatin+Proteins.">ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins.</a> Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Merz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actively+transcribed+rRNA+genes+in+S.+cerevisiae+are+organized+in+a+specialized+chromatin+associated+with+the+high-mobility+group+protein+Hmo1+and+are+largely+devoid+of+histone+molecules.">Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules.</a> Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).</li><li>Schmid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nup-PI:+The+Nucleopore-Promoter+Interaction+of+Genes+in+Yeast.">Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast.</a> Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).</li><li>Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cellular+Ca2++by+yeast+vacuoles.">Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles.</a> J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).</li><li>Gr&#252;nberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediator+binding+to+UASs+is+broadly+uncoupled+from+transcription+and+cooperative+with+TFIID+recruitment+to+promoters.">Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters.</a> The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li><li>Rohland, N., Reich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective,+high-throughput+DNA+sequencing+libraries+for+multiplexed+target+capture.">Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture.</a> Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).</li><li>Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K., Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+regulatory+factors+by+immunoprecipitation+from+native+chromatin.">Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin.</a> Current protocols in molecular biology. 110, 21-25 (2015).</li><li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Combinations+of+Lineage-Determining+Transcription+Factors+Prime+cis-Regulatory+Elements+Required+for+Macrophage+and+B+Cell+Identities.">Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities.</a> Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li><li>Kungulovski, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+histone+modification-specific+interaction+domains+as+an+alternative+to+antibodies.">Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies.</a> Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).</li><li>Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+using+DamID+in+mammalian+cells.">Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).</li><li>Feeser, E. A., Wolberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+Functional+Studies+of+the+Rap1+C-Terminus+Reveal+Novel+Separation-of-Function+Mutants.">Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants.</a> J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).</li><li>Neph, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expansive+human+regulatory+lexicon+encoded+in+transcription+factor+footprints.">An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints.</a> Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).</li><li>Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocortin+receptor-mediated+mobilization+of+intracellular+free+calcium+in+HEK293+cells.">Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells.</a> Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).</li><li>Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-Like+Growth+Factor+Binding+Proteins+Increase+Intracellular+Calcium+Levels+in+Two+Different+Cell+Lines.">Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines.</a> PLoS ONE. 8 (3), e59323 (2013).</li><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Calcium+in+Neurons.">Imaging Calcium in Neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Filion, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Protein+Location+Mapping+Reveals+Five+Principal+Chromatin+Types+in+Drosophila+Cells.">Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells.</a> Cell. 143 (2), 212-224 (2010).</li><li>van Bemmel, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Network+Model+of+the+Molecular+Organization+of+Chromatin+in+Drosophila.">A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila.</a> Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).</li><li>Izzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genomic+Landscape+of+the+Somatic+Linker+Histone+Subtypes+H1.1+to+H1.5+in+Human+Cells.">The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells.</a> Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).</li></ol>

우리는 ChEC가 다양한 종류의 효모 단백질을 염색질에 매핑 할 수 있으며, 효모의 다른 계열의 TF 및 기타 염색질 결합 인자에 널리 적용될 것으로 예상합니다. ChEC-seq은 가교 결합, 크로 마틴 가용화 또는 항체가 필요 없다는 점에서 유리하다. 따라서 ChEC는 불완전한 단백질 가용화로 인한 거짓 네거티브와 같은 hyper-ChIPable 아티팩트 3 , 4 및 기본 칩과 같?...

전사 인자 (TF), 염색질 리모델러 및 기타 염색질 관련 규제 요소의 결합 부위를 매핑하는 것이 모든 염색소 기반 프로세스를 이해하는 데 중요합니다. 염색질 면역 침전 및 높은 처리량 시퀀싱 (ChIP-seq) 접근법은 게놈 생물학에 대한 많은 중요한 통찰력을 얻기 위해 사용되었지만 주목할만한 한계가 있습니다. 우리는 최근 이러한 단점을 피하기 위해 염색질 내인성 절단 및 높은 처리량 시퀀싱 (ChEC - seq) 1 라고하는 대체 방법을 도입했습니다. ChIP-seq는 단백질 -DNA 상호 작용을 보존하기 위해 초기 포름 알데히드 가교 결합 단계 (X-ChIP-seq)로 수행되는 것이 가장 일반적입니다. 그러나 최근의 여러 연구에 따르면 X-ChIP-seq는 일시적 또는 비특이적 단백질 -DNA 상호 작용을 2 , 3 , 4 , 5 &lt;거짓 양성 결합 부위를 유발하는 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 또한 X-ChIP-seq 실험에서 염색질을 단편화하는 데 일반적으로 사용되는 초음파 처리는 열린 염색질의 영역을 우선적으로 절단하여이 영역에서 단편의 편향된 회수를 유도합니다 9 , 10 . Sonication 또한 exonuclease 소화 단계의 추가가 크게 해상도 11 , 12 을 향상시킬 수 있지만, 단편 길이의 이질적인 혼합물을 궁극적으로 바인딩 사이트 해상도를 제한한다. 친화도가 높고 자연적으로 분리 된 염색질 (ORGANIC) 13 에서 게놈의 점령 된 영역과 같은 기본 ChIP 방법은 포름 알데히이드 가교 결합 및 초음파 처리와 관련된 잠재적 인 편향을 경감시켜 미세 크로스 캡슐 핵산 분해 효소 (MNase)와 교차 결합 및 크로 마틴 조각을 사용하지 않습니다. 하나,네이티브 염색질 추출에 필요한 비교적 온화한 조건에서 많은 염색질 결합 단백질의 용해도가 낮아 잠재적으로 동적 범위 및 / 또는 거짓 네거티브 14 가 감소합니다. ChIP-seq의 다양한 반복이 단백질 -DNA 상호 작용의 게놈 - 전체 매핑에 가장 일반적으로 사용되는 반면, 관심있는 단백질과 다양한 DNA- 변형 효소의 융합을 기반으로하는 여러 매핑 기술이 구현되었다. 이러한 접근법 중 하나는 목적하는 염색질 결합 단백질이 댐에 유 전적으로 융합되고이 융합이 세포 또는 동물에서 발현되어 단백질 결합 부위에 인접한 GATC 서열의 메틸화를 초래하는 DNA 아데닌 메틸 전이 효소 동정 (DamID) 15 이다. DamID는 면역 침강에 의존하지 않으며 가교 결합, 항체 또는 염색질 가용화를 피할 수 있다는 점에서 유리하다. 그것은 또한 생체 내에서 수행 됩니다. 하나, DamID의 분해능은 킬로베이스 스케일로 제한되며, 댐 융합 단백질의 메틸화 활성은 구성 성이다. 효소 결합에 기초한 두 번째 방법은 트랜스포존에 대한 관심있는 인자의 융합을 이용하여 트랜스포존의 부위 특이 적 통합을 지시하는 Calling Card-seq 16 이다. DamID와 마찬가지로, Calling Card-seq은 면역 침강을 기반으로하지 않으므로 증가 된 해상도의 이점이있는 유사한 장점이 있습니다. 그러나, Calling Card-seq은 트랜스포존의 서열 편향에 의해 제한 될 수 있으며 또한 트랜스포존 삽입 부위에 가까운 제한 효소의 존재에 의존한다. Laemmli 연구실에서 개발 된 세 번째 효소 융합 방법은 염색질 내인성 절단 (ChEC) 17 입니다. ChEC에서는 염색질 관련 단백질과 MNase 사이의 융합이 세포에서 발현되며, MNase를 활성화시키기 위해 칼슘을 첨가하면 DNA가 태그가 붙은 결합 부위 근방에서 절단됩니다요인 ( 그림 1 ). Southern blotting과 함께, ChEC는 yeast 17 , 18 에서 다수의 개별 유전자좌에서 염색질 구조와 단백질 결합을 특성화하는데 사용되어 왔으며 , 저해상도 마이크로 어레이 분석과 결합하여 핵 세공 성분과 효모의 상호 작용을 조사했다 게놈 19 . ChEC는 DamID 및 Calling Card-seq와 유사한 이점을 제공하며, primer extension 19로 분석 할 때 그 해상도는 거의 단일 염기 쌍이다. ChEC는 또한 조절할 수 있습니다 : MNase에 의한 견고한 DNA 절단은 밀리몰 칼슘의 첨가에 달려있어 MNase는 살아있는 효모 세포에서 관찰되는 낮은 유리 칼슘 농도에서 불활성입니다 20 . 이전에 우리는 ChEC와 고효율 시퀀싱 (ChEC-seq)을 결합하면 TF 바인딩 사이트의 고해상도 맵을 제공 할 것이라고 가정했습니다. 사실, ChEC-seq는 게놈 1을 가로 지르는 신진 효모 일반 조절 인자 (Abf1, Rap1, Reb1)의 고해상도지도를 생성했습니다. 우리는 또한 ChEC-seq를 DNA와 직접 접촉하지 않고 ChIP-seq로지도 화하기 어려울 수있는 메가 달톤 크기의 복합체로 ChEC-seq의 적용 가능성을 확대하는 보존 된 필수 전사 전사 보조 활성제 인 모듈 형 Mediator 복합체에 성공적으로 적용했습니다. 기반 방법. ChEC-seq는 ChIP-seq 결과를 독립적으로 검증하고 염색질 상주 프로세스의 규제에 대한 새로운 통찰력을 창출하는 강력한 방법입니다. 여기, 출연 효모에서이 방법을 구현하기위한 단계별 프로토콜을 제시합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">dNTPs</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0447</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Q5 high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0491L</td>
			<td>Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10488085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0273L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:307px;">cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11836170001</td>
			<td>It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit Mnase cleavage by chelation of Ca2+.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">PMSF</td>
			<td style="width:159px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC215740010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Digitonin, High Purity</td>
			<td style="width:159px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">300410-250MG</td>
			<td>Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Proteinase K, 20 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">RNase A, 10 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Ampure XP beads</td>
			<td style="width:159px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td>Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">MagneSphere magnetic rack</td>
			<td style="width:159px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">Z5342</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide mapping of protein-dna interactions with chec-seq in saccharomyces cerevisiae

게놈 전체에 걸친 단백질 -DNA 상호 작용의 매핑은 유전자 조절, 염색질 재구성 및 기타 염색질 상주 과정을 이해하는 데 중요합니다. 염색질 면역 침전 및 높은 처리량 시퀀싱 (X-ChIP-seq)에 따른 포름 알데히이드 가교는 게놈 생물학에 대한 많은 가치있는 통찰력을 얻기 위해 사용되었습니다. 그러나 X-ChIP-seq는 가교 결합 및 초음파 처리와 관련하여 주목할만한 한계가 있습니다. 네이티브 칩은 가교 결합을 생략함으로써 이러한 결점을 피하지만 종종 크로 마틴 결합 단백질의 빈약 한 회복을 초래합니다. 또한 모든 ChIP 기반 방법은 항체 품질 고려 사항의 적용을받습니다. 단백질을 DNA 변형 효소에 융합시키는 단백질 -DNA 상호 작용을 매핑하는 효소 적 방법도 단백질 -DNA 상호 작용을 매핑하는 데 사용되어왔다. 우리는 최근 ChEC-seq와 같은 high-throughput sequencing을 가진 chromatin endogenous cleavage (ChEC)와 같은 방법을 조합했다. ChEC-seq은 염색체 결합체 (chromatin-assoc)의 융합에 의존한다생균 내 칼슘의 존재하에 표적화 된 DNA 절단을 생성하기 위해 미세 구균 핵산 분해 효소 (MNase)에 관심있는 대상 단백질. ChEC-seq은 면역 침전을 기반으로하지 않으며 가교 결합, 초음파 처리, 염색질 가용화 및 항체 품질에 대한 잠재적 인 우려를 회피하면서 최소한의 배경 신호로 고해상도 매핑을 제공합니다. 우리는 ChEC-seq가 ChIP에 대한 강력한 대응 물이 될 것이며, ChIP-seq 발견을 검증하고 게놈 규제에 대한 새로운 통찰력을 발견 할 수있는 독립적 인 수단을 제공 할 것이라고 기대한다.

성공적인 ChEC 실험의 경우, 아가로 오스 겔 전기 영동에 의한 DNA 분석은 게놈 DNA의 번짐 및 최종 완전한 소화에 의해 지시 된 바와 같이, DNA 단편화에 따른 칼슘 의존성 증가를 나타낼 것이다. 어떤 경우에는 전통적인 MNase 소화와 비슷한 밴드 사다리가 확장 소화 후에 관찰됩니다. 이것은 nucleosome-depleted regions (NDRs)에 결합하는 일반적인 조절 인자 인 Reb1의 ChEC 분석의 경우?...

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Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

우리는 micrococcal nuclease (MNase) 융합 단백질로 게놈 전체 단백질 바인딩 사이트를 매핑하기위한 염색질 immunoprecipitation (ChIP) - 직교 방식 높은 처리량 시퀀싱 (ChEC - seq)와 결합 염색질 내생 절단을 설명합니다.

ChEC-seq와의 단백질 - DNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

DNA 콘텐츠 측정에 의한 포유 동물 복제 타이밍의 게놈 전체의 결정

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

연구

유전학

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Biotinylated Psoralen을 사용하여 RNA-RNA 상호 작용을 세계적으로 매핑

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

ATAC Seq에 의해 기본 인간 T 림프 톨에 게놈 넓은 접근 Chromatin 매핑

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

확산 및 무부하 인간의 섬유 아 세포의 게놈 넓은 사본 감소율을 결정

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

단단히 준비 초기 초파리 배아에서 게놈 넓은 Chromatin 구조 캡처 라이브러리의 생성

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

히스톤 수정 Saccharomyces cerevisiae 에서 chromatin Immunoprecipitation (칩)

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

발기인 캡처 안녕-c: 고해상도, 게놈 넓은 발기인 상호 작용의 프로 파일링

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

진 핵 생물의 전사 오류의 게놈 넓은 감시

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil와의 정량화로 대사 새로 합성 mRNA로 RNA 중 합 효소 II 활동에 대 한 프록시

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

게놈 전체 상호 Hemizygosity 분석을 통해 사카로 마이스 효모의 종 간의 열내성 차이의 유전 매핑

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...