Name: genome-wide mapping of protein-dna interactions with chec-seq in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2017-06-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Мы благодарим Мустафу Салеха и Джей Туиньи за критическое чтение рукописи и Стивена Хана и Стивена Хеникова за наставничество и поддержку во время разработки ChEC-seq и его применения к медиаторскому комплексу. SG поддерживается грантами NIH R01GM053451 и R01GM075114, а GEZ поддерживается фондами запуска Университета штата Индиана.

1. Генерация дрожжевых штаммов <ol><li> Генерируйте дрожжевой штамм, несущий фактор интереса, помеченный MNase. <ol><li> ПЦР амплифицируют кассету для маркировки MNase из желаемого вектора ( таблица 1 ), используя указанную реакционную смесь ( таблица 2 ) и условия циклиро?...

<ol>
	<li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nat Commun. 6, 8733 (2015).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Dynamics+of+Enhanceosome+Assembly+in+Embryonic+Stem+Cells.">Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).</li><li>Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+expressed+loci+are+vulnerable+to+misleading+ChIP+localization+of+multiple+unrelated+proteins.">Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).</li><li>Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+Misinterpretable+ChIP-seq+Bias+in+Yeast.">Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast.</a> PLoS ONE. 8 (12), 83506 (2013).</li><li>Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+promoters+give+rise+to+false+positive+'Phantom+Peaks'+in+ChIP-seq+experiments.">Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li><li>Krebs, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+transcription+factor+binding+map+accuracy+utilizing+knockout-mouse+models.">Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models.</a> Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).</li><li>Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Association+of+Mediator+and+RNA+Polymerase+II+in+Wild-Type+and+Mediator+Mutant+Yeast.">Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast.</a> Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).</li><li>Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-targeted+transcription+factors+motifs+are+a+systemic+component+of+ChIP-seq+datasets.">Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets.</a> Genome Biol. 15 (7), 412 (2014).</li><li>Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+Signals+in+Sequencing-Based+Chromatin-ImmunoPrecipitation+Control+Libraries.">Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries.</a> PLoS ONE. 4 (4), 5241 (2009).</li><li>Teytelman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Chromatin+Structures+on+DNA+Processing+for+Genomic+Analyses.">Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses.</a> PLoS ONE. 4 (8), 6700 (2009).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Genome-wide+Protein-DNA+Interactions+Detected+at+Single-Nucleotide+Resolution.">Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li><li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints.">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).</li><li>Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+of+transcription+factor+binding+sites+on+native+chromatin.">High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin.</a> Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).</li><li>Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleosomal+barrier+to+promoter+escape+by+RNA+polymerase+II+is+overcome+by+the+chromatin+remodeler+Chd1.">The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1.</a> eLife. 3, 02042 (2014).</li><li>Aughey, G. N., Southall, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dam+it's+good!+DamID+profiling+of+protein-DNA+interactions.">Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).</li><li>Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calling+Cards+enable+multiplexed+identification+of+the+genomic+targets+of+DNA-binding+proteins.">Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins.</a> Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIC+and+ChEC:+Genomic+Mapping+of+Chromatin+Proteins.">ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins.</a> Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Merz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actively+transcribed+rRNA+genes+in+S.+cerevisiae+are+organized+in+a+specialized+chromatin+associated+with+the+high-mobility+group+protein+Hmo1+and+are+largely+devoid+of+histone+molecules.">Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules.</a> Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).</li><li>Schmid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nup-PI:+The+Nucleopore-Promoter+Interaction+of+Genes+in+Yeast.">Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast.</a> Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).</li><li>Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cellular+Ca2++by+yeast+vacuoles.">Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles.</a> J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).</li><li>Gr&#252;nberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediator+binding+to+UASs+is+broadly+uncoupled+from+transcription+and+cooperative+with+TFIID+recruitment+to+promoters.">Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters.</a> The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li><li>Rohland, N., Reich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective,+high-throughput+DNA+sequencing+libraries+for+multiplexed+target+capture.">Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture.</a> Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).</li><li>Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K., Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+regulatory+factors+by+immunoprecipitation+from+native+chromatin.">Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin.</a> Current protocols in molecular biology. 110, 21-25 (2015).</li><li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Combinations+of+Lineage-Determining+Transcription+Factors+Prime+cis-Regulatory+Elements+Required+for+Macrophage+and+B+Cell+Identities.">Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities.</a> Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li><li>Kungulovski, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+histone+modification-specific+interaction+domains+as+an+alternative+to+antibodies.">Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies.</a> Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).</li><li>Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+using+DamID+in+mammalian+cells.">Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).</li><li>Feeser, E. A., Wolberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+Functional+Studies+of+the+Rap1+C-Terminus+Reveal+Novel+Separation-of-Function+Mutants.">Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants.</a> J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).</li><li>Neph, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expansive+human+regulatory+lexicon+encoded+in+transcription+factor+footprints.">An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints.</a> Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).</li><li>Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocortin+receptor-mediated+mobilization+of+intracellular+free+calcium+in+HEK293+cells.">Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells.</a> Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).</li><li>Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-Like+Growth+Factor+Binding+Proteins+Increase+Intracellular+Calcium+Levels+in+Two+Different+Cell+Lines.">Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines.</a> PLoS ONE. 8 (3), e59323 (2013).</li><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Calcium+in+Neurons.">Imaging Calcium in Neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Filion, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Protein+Location+Mapping+Reveals+Five+Principal+Chromatin+Types+in+Drosophila+Cells.">Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells.</a> Cell. 143 (2), 212-224 (2010).</li><li>van Bemmel, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Network+Model+of+the+Molecular+Organization+of+Chromatin+in+Drosophila.">A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila.</a> Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).</li><li>Izzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genomic+Landscape+of+the+Somatic+Linker+Histone+Subtypes+H1.1+to+H1.5+in+Human+Cells.">The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells.</a> Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).</li></ol>

Мы показали, что ChEC может отображать различные типы дрожжевых белков на хроматине и предвидеть, что он будет широко применяться к различным семействам TF и ​​другим хроматин-связывающим факторам у дрожжей. ChEC-seq выгоден тем, что он не требует сшивки, солюбилизации хроматина или антител....

Сопоставление сайтов связывания факторов транскрипции (ТФ), ремоделиров хроматина и других связанных с хроматином регуляторных факторов является ключом к пониманию всех процессов на основе хроматина. В то время как подходы хромотанового иммунопреципитации и высокопроизводительного секвенирования (ChIP-seq) были использованы для получения многих важных сведений о биологии генома, они имеют значительные ограничения. Недавно мы представили альтернативный метод, называемый эндогенным расщеплением хроматина и секвенированием с высокой пропускной способностью (ChEC-seq) 1 , чтобы обойти эти недостатки. ChIP-seq чаще всего проводят с начальной стадией поперечной сшивки формальдегида (X-ChIP-seq) для сохранения взаимодействия белок-ДНК. Однако в ряде недавних исследований было показано, что X-ChIP-seq захватывает переходные или неспецифические белково-ДНК-взаимодействия 2 , 3 , 4 , 5 &lt;Sup&gt;, 6 , 7 , 8 , что приводит к появлению ложноположительных сайтов связывания. Кроме того, обработка ультразвуком, обычно используемая для фрагментации хроматина в экспериментах X-ChIP-seq, предпочтительно сдвигает области открытого хроматина, что приводит к необъективному извлечению фрагментов из этих областей 9 , 10 . Ультразвук также дает гетерогенную смесь длин фрагментов, в конечном счете ограничивая разрешение сайта-сайта, хотя добавление стадии экстрагирования экзонуклеазой может значительно улучшить разрешение 11 , 12 . Нативные методы ChIP, такие как оккупированные области геномов из очищенного от аффинности естественно выделенного хроматина (ORGANIC) 13 , не используют сшивание и фрагмент хроматина с микрококковой нуклеазой (MNase), уменьшая потенциальные смещения, связанные с сшиванием формальдегида и ультразвуком. Однако,Растворимость многих белков, связанных хроматинами, в относительно мягких условиях, необходимых для естественной экстракции хроматина, является плохим, что потенциально приводит к уменьшению динамического диапазона и / или ложных негативов 14 . В то время как различные итерации ChIP-seq наиболее часто используются для картирования белок-ДНК в геноме, были также реализованы несколько методов картирования, основанных на слиянии белков, представляющих интерес для различных модифицирующих ДНК ферментов. Одним из таких подходов является идентификация ДНК-аденин-метилтрансферазы ДНК (DamID) 15 , где интересующий хроматин белок, представляющий интерес, генетически слит с плотиной, и этот синтез экспрессируется в клетках или животных, что приводит к метилированию последовательностей GATC, близких к сайтам связывания белка. DamID выгодно тем, что он не полагается на иммунопреципитацию и поэтому избегает сшивания, антител или солюбилизации хроматина. Он также выполняется in vivo . Однако, Разрешение DamID ограничено шкалой килобаз, и метилирующая активность слитого белка плотины является конститутивной. Второй способ, основанный на ферментативном слиянии, - это Calling Card-seq 16 , в котором используется слияние интересующего фактора с транспозазой, направляя специфическую для сайта интеграцию транспозонов. Подобно DamID, Calling Card-seq не основан на иммунопреципитации и, следовательно, имеет схожие преимущества, с дополнительным преимуществом повышенного разрешения. Однако Call-Card-seq может быть ограничена последовательными смещениями транспозаз и также зависит от наличия сайтов рестрикции, близких к сайтам вставки транспозонов. Третий метод ферментативного слияния, разработанный в лаборатории Laemmli, представляет собой эндогенное расщепление хроматина (ChEC) 17 . В ChEC слияние между хроматин-ассоциированным белком и MNase экспрессируется в клетках, а после добавления кальция для активации MNase ДНК расщепляется проксимально к сайтам связывания для меченыхФактора ( рис. 1 ). В сочетании с Саузерн-блоттингом ChEC использовался для характеристики структуры хроматина и связывания белка в ряде отдельных локусов в дрожжах 17 , 18 и был объединен с микроматричным анализом с низким разрешением для зондирования взаимодействия компонентов ядерных пор с дрожжами Геном 19 . ChEC предлагает преимущества, подобные DamID и Calling Card-seq, и его разрешение почти однопалубной пары при анализе с помощью расширения 19 праймера. ChEC также контролируема: надежное расщепление ДНК с помощью MNase зависит от добавления миллимолярного кальция, гарантируя, что MNase неактивен при низких концентрациях свободного кальция, наблюдаемых в живых дрожжевых клетках 20 . Ранее мы предположили, что объединение ChEC с высокопроизводительным секвенированием (ChEC-seq) обеспечит карты с высоким разрешением сайтов привязки TF. Действительно, ChEC-seq генерирует карты высокого разрешения почкообразующих общих регуляторных факторов (GRF) Abf1, Rap1 и Reb1 в геноме 1 . Мы также успешно применили ChEC-seq к модульному медиаторному комплексу, сохраняющемуся, существенному глобальному транскрипционному коактиватору 21 , расширяющему применимость ChEC-seq к комплексам размером в мегадальтон, которые напрямую не связаны с ДНК и могут быть трудно отображены ChIP- Основанные методы. ChEC-seq является мощным методом как для независимой проверки результатов ChIP-seq, так и для генерации новых представлений о регулировании хроматин-резидентных процессов. Здесь мы представляем пошаговый протокол для реализации этого метода в почкодоносных дрожжах.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">dNTPs</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0447</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Q5 high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0491L</td>
			<td>Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10488085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0273L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:307px;">cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11836170001</td>
			<td>It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit Mnase cleavage by chelation of Ca2+.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">PMSF</td>
			<td style="width:159px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC215740010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Digitonin, High Purity</td>
			<td style="width:159px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">300410-250MG</td>
			<td>Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Proteinase K, 20 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">RNase A, 10 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Ampure XP beads</td>
			<td style="width:159px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td>Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">MagneSphere magnetic rack</td>
			<td style="width:159px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">Z5342</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide mapping of protein-dna interactions with chec-seq in saccharomyces cerevisiae

Геномное картирование взаимодействия белок-ДНК имеет решающее значение для понимания регуляции генов, ремоделирования хроматина и других хроматиновых резидентных процессов. Сформирование формальдегида с последующей иммунопреципитацией хроматина и секвенированием с высокой пропускной способностью (X-ChIP-seq) было использовано для получения многих ценных сведений о биологии генома. Однако X-ChIP-seq имеет значительные ограничения, связанные с сшиванием и ультразвуком. Родной ChIP избегает этих недостатков, исключая сшивание, но часто приводит к плохому восстановлению связанных с хроматином белков. Кроме того, все методы на основе ChIP подвержены соображениям качества антител. Для картирования белково-ДНК-взаимодействий также использовались ферментативные методы картирования белково-ДНК-взаимодействий, которые включают слияние белка, представляющего интерес для модифицирующего ДНК фермента. Недавно мы объединили один такой метод - хроническое эндогенное расщепление (ChEC), с высокопроизводительным секвенированием как ChEC-seq. ChEC-seq полагается на слияние хроматина-ассоциированногоКоторый представляет интерес для микрококковой нуклеазы (МНКазы) для получения целенаправленного расщепления ДНК в присутствии кальция в живых клетках. ChEC-seq не основан на иммунопреципитации и поэтому обходит потенциальные проблемы с сшиванием, ультразвуком, солюбилизацией хроматина и качеством антител, обеспечивая при этом отображение высокого разрешения с минимальным фоновым сигналом. Мы предполагаем, что ChEC-seq станет мощным партнером ChIP, предоставляя независимые средства, позволяющие как проверять результаты ChIP-seq, так и открывать новые представления о геномном регулировании.

В случае успешного эксперимента ChEC анализ ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле выявит зависимое от кальция увеличение фрагментации ДНК в течение времени, о чем свидетельствует размывание и возможное полное переваривание геномной ДНК. В некоторых случаях пос...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Мы описываем эндогенное расщепление хроматина в сочетании с высокопроизводительным секвенированием (ChEC-seq), хромопатическим иммунопреципитацией (ChIP) -ортогональным методом для картирования сайтов связывания с белками генома с гибридными белками с микрококковой нуклеазой (MNase).

Геномное картирование белково-ДНК-взаимодействий с ChEC-seq in<em&gt; Разное</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Генома Определение МЛЕКОПИТАЮЩИХ репликации ДНК с помощью Timing Content измерения

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Сопоставление взаимодействия РНК-РНК в глобальном масштабе с использованием биотинилированного псоралена

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Картирование генома всей доступной хроматина в основной человеческий Т-лимфоцитов, ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Определение генома всей стенограммы распада ставок в пролиферирующих и покоя фибробластов

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Поколение генома общесистемной Chromatin конформации захвата библиотек из плотно поставил раннего дрозофилы эмбрионов

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Иммунопреципитации Chromatin (чип) изменения гистона от Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Промоутер захват Привет C: С высоким разрешением, геном общесистемной Профилирование взаимодействия промоутер

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Геном широкий наблюдения ошибок транскрипции в эукариотических организмов

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Пивоваренные дрожжи Метаболические маркировки с 4-thiouracil и количественная оценка недавно синтезированных мРНК как прокси для РНК-полимераза II деятельности

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Генетическое картирование различий термотерпимости между видами дрожжей Сахаромицес с помощью геномно-широкого взаимного анализа гемизигоси

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...