Name: genome-wide mapping of protein-dna interactions with chec-seq in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2017-06-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Vi tackar Moustafa Saleh och Jay Tourigny för kritisk läsning av manuskriptet och Steven Hahn och Steven Henikoff för mentorskap och support under utvecklingen av ChEC-seq och dess tillämpning på Mediator-komplexet. SG stöds av NIH-bidrag R01GM053451 och R01GM075114 och GEZ stöds av Indiana University startup funds.

1. Generering av jäststammar <ol><li> Generera en jäststam som bär den faktor av intresse som är märkt med MNase. <ol><li> PCR förstärker MNas-märkningskassetten från den önskade vektorn ( tabell 1 ) med användning av den angivna reaktionsblandningen ( tabell 2 ) och cykliska betingelser ( tabell 3 ). Blanda 5 μl av PCR-reaktionen och 1 μl 6X DNA-laddningsfärg. Kör varje PCR-alikvot på en 0,8% agarosgel vid 120 V under 40 min. Den för...

<ol>
	<li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nat Commun. 6, 8733 (2015).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Dynamics+of+Enhanceosome+Assembly+in+Embryonic+Stem+Cells.">Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).</li><li>Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+expressed+loci+are+vulnerable+to+misleading+ChIP+localization+of+multiple+unrelated+proteins.">Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).</li><li>Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+Misinterpretable+ChIP-seq+Bias+in+Yeast.">Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast.</a> PLoS ONE. 8 (12), 83506 (2013).</li><li>Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+promoters+give+rise+to+false+positive+'Phantom+Peaks'+in+ChIP-seq+experiments.">Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li><li>Krebs, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+transcription+factor+binding+map+accuracy+utilizing+knockout-mouse+models.">Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models.</a> Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).</li><li>Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Association+of+Mediator+and+RNA+Polymerase+II+in+Wild-Type+and+Mediator+Mutant+Yeast.">Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast.</a> Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).</li><li>Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-targeted+transcription+factors+motifs+are+a+systemic+component+of+ChIP-seq+datasets.">Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets.</a> Genome Biol. 15 (7), 412 (2014).</li><li>Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+Signals+in+Sequencing-Based+Chromatin-ImmunoPrecipitation+Control+Libraries.">Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries.</a> PLoS ONE. 4 (4), 5241 (2009).</li><li>Teytelman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Chromatin+Structures+on+DNA+Processing+for+Genomic+Analyses.">Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses.</a> PLoS ONE. 4 (8), 6700 (2009).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Genome-wide+Protein-DNA+Interactions+Detected+at+Single-Nucleotide+Resolution.">Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li><li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints.">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).</li><li>Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+of+transcription+factor+binding+sites+on+native+chromatin.">High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin.</a> Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).</li><li>Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleosomal+barrier+to+promoter+escape+by+RNA+polymerase+II+is+overcome+by+the+chromatin+remodeler+Chd1.">The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1.</a> eLife. 3, 02042 (2014).</li><li>Aughey, G. N., Southall, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dam+it's+good!+DamID+profiling+of+protein-DNA+interactions.">Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).</li><li>Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calling+Cards+enable+multiplexed+identification+of+the+genomic+targets+of+DNA-binding+proteins.">Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins.</a> Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIC+and+ChEC:+Genomic+Mapping+of+Chromatin+Proteins.">ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins.</a> Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Merz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actively+transcribed+rRNA+genes+in+S.+cerevisiae+are+organized+in+a+specialized+chromatin+associated+with+the+high-mobility+group+protein+Hmo1+and+are+largely+devoid+of+histone+molecules.">Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules.</a> Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).</li><li>Schmid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nup-PI:+The+Nucleopore-Promoter+Interaction+of+Genes+in+Yeast.">Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast.</a> Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).</li><li>Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cellular+Ca2++by+yeast+vacuoles.">Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles.</a> J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).</li><li>Gr&#252;nberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediator+binding+to+UASs+is+broadly+uncoupled+from+transcription+and+cooperative+with+TFIID+recruitment+to+promoters.">Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters.</a> The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li><li>Rohland, N., Reich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective,+high-throughput+DNA+sequencing+libraries+for+multiplexed+target+capture.">Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture.</a> Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).</li><li>Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K., Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+regulatory+factors+by+immunoprecipitation+from+native+chromatin.">Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin.</a> Current protocols in molecular biology. 110, 21-25 (2015).</li><li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Combinations+of+Lineage-Determining+Transcription+Factors+Prime+cis-Regulatory+Elements+Required+for+Macrophage+and+B+Cell+Identities.">Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities.</a> Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li><li>Kungulovski, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+histone+modification-specific+interaction+domains+as+an+alternative+to+antibodies.">Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies.</a> Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).</li><li>Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+using+DamID+in+mammalian+cells.">Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).</li><li>Feeser, E. A., Wolberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+Functional+Studies+of+the+Rap1+C-Terminus+Reveal+Novel+Separation-of-Function+Mutants.">Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants.</a> J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).</li><li>Neph, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expansive+human+regulatory+lexicon+encoded+in+transcription+factor+footprints.">An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints.</a> Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).</li><li>Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocortin+receptor-mediated+mobilization+of+intracellular+free+calcium+in+HEK293+cells.">Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells.</a> Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).</li><li>Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-Like+Growth+Factor+Binding+Proteins+Increase+Intracellular+Calcium+Levels+in+Two+Different+Cell+Lines.">Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines.</a> PLoS ONE. 8 (3), e59323 (2013).</li><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Calcium+in+Neurons.">Imaging Calcium in Neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Filion, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Protein+Location+Mapping+Reveals+Five+Principal+Chromatin+Types+in+Drosophila+Cells.">Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells.</a> Cell. 143 (2), 212-224 (2010).</li><li>van Bemmel, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Network+Model+of+the+Molecular+Organization+of+Chromatin+in+Drosophila.">A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila.</a> Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).</li><li>Izzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genomic+Landscape+of+the+Somatic+Linker+Histone+Subtypes+H1.1+to+H1.5+in+Human+Cells.">The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells.</a> Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).</li></ol>

Vi har visat att ChEC kan kartlägga olika klasser av jästproteiner på kromatin och förutse att det kommer att vara allmänt tillämpligt på olika familjer av TF och andra kromatinbindande faktorer i jäst. ChEC-seq är fördelaktigt genom att det inte kräver tvärbindning, kromatinsolubilisering eller antikroppar. Således undviker ChEC artefakter som är potentiellt närvarande i X-ChIP-seq, såsom hyper-ChIPable artefact 3 , 4 och native ChIP, såsom fal...

Kartläggning av bindningsställena för transkriptionsfaktorer (TF), kromatinomvandlare och andra kromatinrelaterade reglerande faktorer är nyckeln till att förstå alla kromatinbaserade processer. Medan kromatinimmunutfällning och hög genomströmningssekvensering (ChIP-seq) -metoder har använts för att få många viktiga insikter i genombiologi, har de anmärkningsvärda begränsningar. Vi introducerade nyligen en alternativ metod, kallad kromatin endogen klyvning och hög genomströmning sekvensering (ChEC-seq) 1 , för att kringgå dessa nackdelar. ChIP-seq utförs oftast med ett initialt formaldehydtvärbindningssteg (X-ChIP-seq) för att bevara protein-DNA-interaktioner. Emellertid har ett antal nyligen genomförda studier visat att X-ChIP-seq fångar transienta eller icke-specifika protein-DNA-interaktioner 2 , 3 , 4 , 5 &lt;Sup&gt;, 6 , 7 , 8 , vilket ger upphov till falska positiva bindningsställen. Dessutom användes sonikering, som vanligtvis användes för fragmentering av kromatin i X-ChIP-seq-experiment, företrädesvis skjuvregioner av öppen kromatin, vilket ledde till förspänd återvinning av fragment från dessa regioner 9 , 10 . Sonikering ger också en heterogen blandning av fragmentlängder, som slutligen begränsar bindningsställningsupplösningen, även om tillsatsen av ett exonukleas-digestionssteg avsevärt kan förbättra upplösningen 11 , 12 . Native ChIP-metoder, såsom upptagna regioner av genomer från affinitetsrenat naturligt isolerat kromatin (ORGANISKT) 13, använder inte tvärbindning och fragmentkromatin med mikrokocknukleas (MNas), lindrar potentiella biaser associerade med formaldehyd-tvärbindning och sonikering. Dock,Lösligheten hos många kromatinbundna proteiner under de relativt milda betingelser som krävs för nativ kromatinutvinning är dålig, vilket potentiellt leder till reducerat dynamiskt område och / eller falska negativa 14 . Medan olika iterationer av ChIP-seq vanligen används för genombildning av proteiner med DNA-genomslag, har flera kartläggningstekniker baserade på fusion av proteiner av intresse för olika DNA-modifierande enzymer också implementerats. Ett sådant tillvägagångssätt är DNA-adeninmetyltransferasidentifiering (DamID) 15 , där ett kromatinbindande protein av intresse är genetiskt smält till Dam och denna fusion uttrycks i celler eller djur, vilket resulterar i metylering av GATC-sekvenser som är proximala till bindningsställen för proteinet. DamID är fördelaktigt genom att det inte är beroende av immunutfällning och sålunda undviker tvärbindning, antikroppar eller kromatinsolubilisering. Det utförs också in vivo . dock, Är upplösningen av DamID begränsad till kilobasskalan och metyleringsaktiviteten hos Dam-fusionsproteinet är konstitutiv. En andra metod baserad på enzymatisk fusion är Calling Card-seq 16 , som använder fusion av en faktor av intresse för ett transposas, vilket riktar platsspecifik integration av transposoner. Liksom DamID är Calling Card-seq inte baserat på immunutfällning och har därmed liknande fördelar, med den extra fördelen med ökad upplösning. Calling Card-seq kan emellertid begränsas av sekvensbiaser av transposaser och är också beroende av närvaron av restriktionsställen nära transposoninsättningsställen. En tredje enzymatisk fusionsmetod, som utvecklats i Laemmli-lab, är kromatin-endogen klyvning (ChEC) 17 . I ChEC uttrycks en fusion mellan ett kromatinassocierat protein och MNas i celler och vid kalciumtillägg för aktivering av MNas klyvs DNA proximalt till bindningsställen för den märktaFaktor ( figur 1 ). I samband med Southern Blotting har ChEC använts för att karakterisera kromatinstruktur och proteinbindning vid ett antal enskilda loci i jäst 17 , 18 och har kombinerats med lågupplösande mikroarrayanalys för att undersöka interaktionen mellan kärnporomponenter med jäst Genom 19 . ChEC erbjuder fördelar som liknar DamID och Calling Card-seq, och dess upplösning är nästan enkelbaspar när det analyseras med primerförlängning 19 . ChEC är också kontrollerbar: Robust DNA-klyvning med MNase beror på tillsats av millimolärt kalcium, vilket säkerställer att MNas är inaktiv vid låga fria kalciumhalter som observeras i levande jästceller 20 . Tidigare postulerade vi att kombinera ChEC med high-throughput-sekvensering (ChEC-seq) skulle tillhandahålla kartor med hög upplösning av TF-bindningsställen. Faktum är att ChEC-seq genererade högupplösta kartor över de generella jäste-generella regleringsfaktorerna (GRF) Abf1, Rap1 och Reb1 över genomet 1 . Vi har också framgångsrikt tillämpat ChEC-seq på det modulära Mediator-komplexet, en konserverad, essentiell global transkriptionell coaktivator 21 , som utvidgar tillämpligheten av ChEC-seq till megadalton-storlekskomplex som inte direkt berör DNA och kan vara svåra att kartlägga med ChIP- Baserade metoder. ChEC-seq är en kraftfull metod både för oberoende validering av ChIP-seq-resultat och generering av nya insikter i reglering av kromatin-residenta processer. Här presenterar vi ett steg för steg protokoll för genomförandet av denna metod i spirande jäst.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">dNTPs</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0447</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Q5 high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0491L</td>
			<td>Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10488085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0273L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:307px;">cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11836170001</td>
			<td>It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit Mnase cleavage by chelation of Ca2+.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">PMSF</td>
			<td style="width:159px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC215740010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Digitonin, High Purity</td>
			<td style="width:159px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">300410-250MG</td>
			<td>Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Proteinase K, 20 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">RNase A, 10 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Ampure XP beads</td>
			<td style="width:159px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td>Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">MagneSphere magnetic rack</td>
			<td style="width:159px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">Z5342</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide mapping of protein-dna interactions with chec-seq in saccharomyces cerevisiae

Genomgående kartläggning av protein-DNA-interaktioner är avgörande för förståelse av genreglering, kromatinreformering och andra kromatin-residenta processer. Formaldehyd-tvärbindning följt av kromatinimmunutfällning och genomströmningssekvensering (X-ChIP-seq) har använts för att få många värdefulla insikter i genombiologi. X-ChIP-seq har dock anmärkningsvärda begränsningar kopplade till tvärbindning och sonikering. Native ChIP undviker dessa nackdelar genom att utelämna tvärbindning, men resulterar ofta i dålig återhämtning av kromatinbundna proteiner. Dessutom är alla ChIP-baserade metoder föremål för antikroppskvalitetshänsyn. Enzymatiska metoder för kartläggning av protein-DNA-interaktioner, som innefattar fusion av ett protein av intresse för ett DNA-modifierande enzym, har också använts för att kartlägga protein-DNA-interaktioner. Vi kombinerade nyligen en sådan metod, kromatin endogen klyvning (ChEC), med hög genomströmnings-sekvensering som ChEC-seq. ChEC-seq bygger på fusion av en kromatin-assocIerat protein av intresse för mikrokocknukleas (MNas) för att generera riktade DNA-klyvning i närvaro av kalcium i levande celler. ChEC-seq är inte baserat på immunutfällning och kringgår sålunda potentiella problem med tvärbindning, sonikering, kromatinlösning och antikroppskvalitet samtidigt som det tillhandahåller högupplösande kartläggning med minimal bakgrundssignal. Vi ser att ChEC-seq kommer att vara en kraftfull motsvarighet till ChIP, vilket ger ett självständigt medel för att både validera ChIP-seq-fynd och upptäcka nya insikter i genomisk reglering.

I fallet med ett framgångsrikt ChEC-experiment kommer analys av DNA genom agarosgelelektrofores att avslöja en kalciumberoende ökning i DNA-fragmenteringstidens över-tid, såsom indikeras genom utsmältning och eventuell fullständig uppslutning av genomiskt DNA. I vissa fall observeras en stege av band liknande den som ses med en traditionell MNase-digestion efter förlängd digestion. Detta är fallet för ChEC-analys av Reb1, en allmän reglerande faktor som binder nukleosomutarma...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Vi beskriver kromatin endogen klyvning i kombination med hög genomströmnings-sekvensering (ChEC-seq), en kromatinimmunpresipitations (ChIP) -orthogonal metod för kartläggning av proteinbindningsställen genomgående med mikrokocknukleas (MNase) fusionsproteiner.

Genomgående kartläggning av protein-DNA-interaktioner med ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genomvid Fastställande av däggdjur Replication Timing av DNA-innehåll Mätning

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kartläggning av RNA-RNA-interaktioner globalt med användning av biotinylerad psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Mappning av Genome-wide tillgängliga kromatin i primära humana T-lymfocyter av ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Fastställande av Genome-wide avskrift Decay priser i prolifererande och Quiescent mänskliga fibroblaster

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation av Genome-wide kromatin konformation fånga bibliotek från tätt stegvis tidiga Drosophila embryon

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) Histon ändringar från Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Arrangören Capture-C: Högupplösta, Genome-wide profilering av promotorn interaktioner

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genome-wide övervakning av transkription fel i eukaryota organismer

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metaboliska märkning med 4-thiouracil och kvantifiering av nyligen syntetiseras mRNA som en Proxy för RNA-polymeras II aktivitet

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetisk kartläggning av Termotolerans skillnader mellan arter av Saccharomyces jäst via Genomomfattande ömsesidig Hemizygosity analys

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...