Name: a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays
Uploaded: 2017-12-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays at JoVE.com

Vi vil gerne takke CSIC for den finansielle støtte til dette projekt, at Mariana Di Doménico for hendes teknisk bistand med konfokalmikroskopi; til José Leonardo Báez for hans manuskript korrektioner; at Luciano Correa for hans dedikation til oprettelse af video; til Natalia Rosano for udlån hendes stemme til videoen og Bloomington Drosophila Stock Center for at give bestandene anvendes i denne undersøgelse. Apa1 monoklonalt anti-Ptc udviklet af Isabel Guerrero var indhentet fra udviklingsmæssige undersøgelser hybridom Bank (DSHB) under ledelse af NICHD og vedligeholdes af The University of Iowa, Biologisk Institut, Iowa City, IA 52242.

Dag 1
1. indsamling og dyrkning pupper.
<ol>
	<li>Fjerne 0 h efter puparium dannelse (APF) eller prepupae ved hjælp af en våd pensel fra kulturperler hætteglas og placere dem i nye hætteglas til næsten komplet udvikling periode (Se 2.1 og 2.2). 
	Bemærk: En sund befolkning af fluer bør opretholdes ved hjælp af standard dyrkningsbaserede protokoller. Efter tre eller fire dage, hvor æggene er lagt, kan voksne fjernes fra hætteglas til at give mulighed for en optimal...

<ol>
	<li>Serrano, N., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limb+morphogenesis:+connections+between+patterning+and+growth.">Limb morphogenesis: connections between patterning and growth.</a> Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+and+appendage+development+in+Drosophila.">Compartments and appendage development in Drosophila.</a> Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).</li><li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+disc+development+in+the+fly:+the+early+stages.">Wing disc development in the fly: the early stages.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).</li><li>Beira, J. V., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+legacy+of+Drosophila+imaginal+discs.">The legacy of Drosophila imaginal discs.</a> Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).</li><li>De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+vein+pattern+variations+in+insect+wings.">Developmental basis for vein pattern variations in insect wings.</a> Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+vein+patterning+in+Drosophila+and+the+analysis+of+intercellular+signaling.">Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+lines+in+the+Drosophila+wing:+initiation+of+wing+vein+development.">Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).</li><li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing:+The+development+of+the+veins.">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li><li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Bolatto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+distribution+of+Patched-related+protein+in+the+Drosophila+embryo.">Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo.</a> Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).</li><li>Zuniga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+encoding+novel+secreted+and+transmembrane+proteins+are+temporally+and+spatially+regulated+during+Drosophila+melanogaster+embryogenesis.">Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis.</a> BMC Biol. 7, 61 (2009).</li></ol>

Metoden for dissektion beskrevet i denne video kan bruges til at forberede høj kvalitet prøver af Drosophila puppe vinger fra forskellige udviklingsfaser for mange typer af teknikker (fx immunofluorescens, cDNA syntese til PCR assays, in vitro- fløj udvikling). Med hensyn til denne metode har videnskabsmand involveret bruges 24-30 h APF. Dog bør der ingen hindring i de afgørende skridt i dissektion af yngre eller ældre puppe. Ændringer kan have til at rumme mindre fase puppe.
<p cla...

Drosophila vinger er udviklet fra wing fantasiens diske. Primordial af disse fløj diske er sat til side under fosterudviklingen som små grupper af 20-30 fantasiens celler, der invaginate fra embryonale epitel. Mens larver vokser til tredje instar fase, forekommer mitose i de imaginære celler på bestemte karakteristiske tidspunkter at hæve sine tal (ca 50000 celler) og danner fløjen disc1,2,3, 4. Da cellerne formere sig, mode de en rørformet epitel, hvilket resulterer i en selvstændig folde kompakte spiral. Under pupation, disc epitel teleskoper ud til form to-lags fløj og de langsgående vener starte som lakuner mellem dem, der forekommer to gange i løbet af wing udviklingsmæssige5,6.
Arrangement af årer altid har en identisk mønster; evne til nemt at identificere hver ændring i venerne dannelse gør mutationer meget synligt (f.eks. manglende eller ekstra årer, ændringer i vene holdninger osv.). Interessant, er fænotype variationer normalt beviser af mutationer i kendte eller nye komponenter af signalering veje, der er relevante for wing udvikling. En af de veje, der spiller en rolle i positioneringen og vedligeholde vene og intervein områder er pindsvin (Hh) vej6,7,8.
Betragtning af betydningen af den puppe fløj som en modelsystem, vil det være vigtigt at få god kvalitet prøver at arbejde med. I fortiden, har forskere, der har publiceret protokoller for at dissekere Drosophila vinger ikke givet en passende vejledning til at opnå brugbare prøver. Uden vejledning af en forsker visualisere ikke et klart processen. I disse alternative dissekere tilgange er puppe delt i to, adskille fløjen fra omkringliggende væv og gentagne gange vaskes for at fjerne snavs. Denne form for tilgang hævder at forlade den fløj gratis forurener, men på grund af tidligere erfaringer processen er langsommere, og der er en højere chance for at gå på kompromis struktur af skrøbelige vinger9.
Proceduren beskrevet her blev udviklet af kravet om at finde en hurtig og effektiv metode til at få puppe wing prøver egnet til at påvise bestemte proteiner eller udskrifter ved hjælp af immunodetection protokoller eller polymerase kædereaktion (PCR) assays. For at illustrere dette, udtryk og lokalisering af Patched (Ptc eller den kanoniske receptor af Hh pathway) er fundet i puppe wing prøver, giver en protokol, der indeholder relevante oplysninger til at gennemføre den komplette procedure.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="809">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:349px;">Stereomicroscope with cool light illumination</td>
			<td style="width:175px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SMZ1000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rocking platform</td>
			<td>Biometra (WT 16)</td>
			<td>042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope slides</td>
			<td>StarFrost</td>
			<td>8037/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover glasses (24 x 32 mm)</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>63-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multi-well plastic dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">p100 or p200 pipette</td>
			<td>Finnpipette (Labsystems)</td>
			<td>9400130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1X PBS (Dulbecco)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Bio Basic INC.</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>5092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TRIzol Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DEPC treated water</td>
			<td>MO.BIO</td>
			<td>17011-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:349px;">Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL 
			(working dilution 1/800)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A11030</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="153">
			<td height="153" style="height:153px;width:349px;">Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 &#956;g/mL 
			(working dilution 1/100)</td>
			<td style="width:175px;">Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:349px;">DAPI, 1 mg/mL 
			(working dilution 1/5000)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">62248</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:349px;">Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol 
			(1/600 working dilution)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:349px;">Canton S (fly stock)</td>
			<td style="width:175px;">Bloomington Drosophila Stock Center&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays

Wing udvikling i Drosophila melanogaster er en ideel model for at studere morfogenese på væv plan. Disse vedhæng udvikle sig fra en gruppe af celler opkaldt wing fantasiens diske dannet under fosterudviklingen. Larve faser vokse af fantasiens diske, øge antallet af celler og danner monolayered epitelial strukturer. Inde i puppe sagen, de imaginære diske bud ud og fold i dobbeltlag langs en linje, der bliver den fremtidige margin af vingen. Under denne proces stammer de langsgående primodia vener vene celler på de potentielle dorsal og ventral overflader af vingen. Den puppe på stadiet kommunikere striber af vene celler af hver overflade for at generere stramme rør; på samme tid begynde cross-vener deres dannelse.
Ved hjælp af passende molekylære markører er det muligt at identificere de vigtigste elementer, komponere fløjen under dets udvikling. Af denne grund er evne til præcist afsløre udskrifter eller proteiner i denne struktur afgørende for at studere deres overflod og lokalisering relateret til udviklingsprocessen af vingen.
Proceduren beskrevet her fokuserer på manipulere puppe vinger, giver detaljerede instruktioner om hvordan man kan dissekere fløjen under den puppe stadie. Dissektion af puppe væv er mere vanskeligt at udføre end deres kolleger i tredje instar larver. Dette er grunden til, at denne tilgang blev udviklet, for at få hurtig og effektiv høj kvalitet prøver. Informationer til immunostain og mount disse fløj prøverne, tillade visualisering af proteiner eller celle komponenter, er fastsat i protokollen. Med lidt ekspertise er det muligt at indsamle 8-10 høj kvalitet puppe vinger i en kort tid.

Protokollen tilbyder en enkel metode til at indhente puppe wing prøver at bevarer den velkendte morfologi af vingen. Fra disse præparater er det muligt at opnå stakkevis af billeder, der kunne blive projekteret som 2D- eller 3D, at undersøge distribution og/eller tilsætning af proteiner under differentiering af vingen. En lignende protokol kan (se note i 2.9) bruges til at indsamle store puppe wing prøven (der involverer 50-80 puppe vinger) nødvendigt at syntetisere supplerende deo...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays at JoVE.com

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Evnen til at præcist afsløre udskrifter eller proteiner i Drosophila væv er kritisk for at studere deres overflod og lokalisering relateret til udviklingsprocessen. Her er beskrivelsen af en ligetil procedure at dissekere puppe vinger. Disse vinger kan bruges som prøver i flere teknikker (immunhistokemi, PCR assay, osv.).

En hurtig og effektiv metode til at dissekere puppe vinger af Drosophila velegnet til Immunodetections eller PCR Assays

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Levende-billeddannelse af<em&gt; Drosophila</em&gt; Puppe Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

En hurtig og effektiv metode til rensning af endoderm celler Genereret fra menneskelige embryonale stamceller

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

En effektiv metode til at opnå dedifferentierede fedtceller

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Hurtig, instrueret differentiering af retinale Pigment epitel celler fra menneskelige embryonale eller induceret pluripotente stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissektion og farvning af Drosophila puppe æggestokke

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Celle sammenlægning Assays til at evaluere bindingen af Drosophila Notch med Trans-ligander og dens hæmning af Cis-ligander

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

En forenklet og effektiv metode til at isolere primære humane keratinocytter fra voksen hudvæv

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

En effektiv strategi til at generere væv-specifikke binære transskription systemer i Drosophila af genom-redigering

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissektion af Drosophila puppe nethinden for immunhistokemi, vestlige analyse og RNA isolering

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Optøning, dyrkning og Cryopreserving Drosophila cellelinjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...